suất của quỏ trỡnh dung hợp.
đối với phương phỏp dung hợp bằng hoỏ chất PEG, ủể xỏc suất tạo ra sự kết dớnh ủụi giữa 2 protoplast của 2 dũng nhị bội khỏc nhau (yếu tố mong muốn cú ủược tạo ủiều kiện cho dung hợp xảy ra trong quỏ trỡnh nuụi cấy tỏi sinh) thỡ việc xỏc ủịnh mật ủộ tế bào thớch hợp của cỏc dũng trước khi dung hợp là rất quan trọng. Nếu mặt ủộ tế bào quỏ thưa thỡ sự kết lắng của protoplast ớt và sẽ bị mất trong qỳa trỡnh dung hợp (khi hỳt bỏ PEG và dung dịch rửa dung hợp), nếu mặt ủộ tế bào quỏ dầy thỡ số tế bào kết dớnh 2 ớt và số tế bào kết dớnh 3,4,Ầnhiều. Hơn nữa nếu mật ủộ protoplast của 2 dũng dung hợp khụng tương thớch thỡ khả năng tạo tế bào lai giữa 2 dũng là rất ớt. Chớnh vỡ vậy chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm sử dụng cỏc mật ủộ protoplast khỏc nhau ủể dung hợp thu ủược hiệu quả cao (xỏc nhận mật ủộ thụng qua việc ủếm tế bào bằng buồng ủếm hồng cầu).
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 57
Tiến hành thớ nghiệm và thu ủược kết quả sau:
Hỡnh 11: Ảnh hưởng của mật ủộ protoplast dung hợp tới hiệu suất của quỏ trỡnh dung hợp.
đếm số protoplast chập ủụi, chập ba sau khi dung hợp ở cỏc mật ủộ khỏc nhau trờn một thị trường của vật kớnh 20. Ta cú bảng sau:
Bảng 9: Sự kết tập của protoplast sau khi dung hợp
Số tế bào dớnh Mật ủụ 2 (protoplast) 3 (protoplast) 2.106tế bào/ml 4 1 2,5.106tế bào/ml 10 3 2,75.106tế bào/ml 13 8 3.106tế bào/ml 9 14 2.106 tế bào/1ml 2,5.106 tế bào/1ml 2,75.106 tếbào/1ml 3.106 tế bào/1ml
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 58
Số tế bào dớnh ủụi, dớnh ba trờn một thị trường ủược hiện qua biểu ủồ
đếm số protoplast chập ủụi, chập ba sau khi dung hợp ở cỏc mật ủộ khỏc nhau trờn một thị trường của vật kớnh 20. Ta cú bảng sau:
Số tế bào dớnh ủụi, dớnh ba trờn một thị trường ủược thể hiện qua biểu ủồ:
0 2 4 6 8 10 12 14 S ố l ư ợ n g c ụ m t ế b à o 2 (protoplast) 3 (protoplast) Số tế bào dớnh Biểu ủồ số tế bào dớnh ủụi, dớnh ba trờn một thị trường vật kớnh 20 Mật ủộ 2.106 tế bào/ml 2,5.106 tế bào/ml 2,75.106 tế bào/ml 3.106 tế bào/ml Nhận xột:
Ở mật ủộ 2.106 tế bào/ml số cụm tế bào dớnh ủụi ớt nhất (4 cụm tế bào) và lượng tế bào cũn lại sau quỏ trỡnh dung hợp ớt do cỏc tế bào lắng ủọng ớt nờn bị hỳt bỏ trong quỏ trỡnh hỳt bỏ dịch rửa dung hợp.
Với mật ủộ 2,75.106 tế bào/ml cho số cụm tế bào dớnh ủụi nhiều nhất (13 cụm) tạo ủiều kiện cho dung hợp của hai tế bào xảy ra với tỷ lệ lớn.
Mật ủộ 3.106 tế bào/ml lại cho cỏc cụm tế bào dớnh ba nhiều nhất, như vậy sẽ xảy ra dung hợp của 3 tế bào với nhau tạo hexaploid với tỷ lệ cao trong khi mong muốn của ta là tạo ra nhiều sự kết dớnh của 2 protoplast.
Như vậy mật ủộ dung hợp 2,75.106 ml/l là mật ủộ thớch hợp nhất cho dung hợp bằng hoỏ chất PEG, ở mật ủộ này thỡ cho số lượng tế bào dớnh ủụi nhiều nhất (13 cụm). Tuy nhiờn mật ủộ dung hợp 2,5.106 tế bào/ml cũng ủược
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 59
coi là mật ủộ dung hợp thớch hợp vỡ số lượng cỏc tế bào dớnh 2 nhiều nhưng so với mật ủộ 2,75.106ml/l thỡ tế bào cũn lại ớt.
Kết luận: mật ủộ protoplast thớch hợp ủể dung hợp là 2.75.106ml/l.
4.7.1.4. Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu ảnh hưởng của phương phỏp rửa PEG khỏc nhau tới chất lượng protoplast sau dung hợp.
Sau khi xỏc ủịnh ủược nồng ủộ PEG, thời gian ủ PEG và mật ủộ dung hợp thớch hợp cho quỏ trỡnh dung hợp thỡ việc xỏc ủịnh phương phỏp ủể rửa sạch PEG sau dung hợp là rất quan trọng. Quỏ trỡnh rửa cú thể làm thất thoỏt 1 lượng lớn cỏc protoplast, hoặc làm chết cỏc protoplast do khụng rửa sạch PEG. Trong thớ nghiệm này chỳng tụi sử dụng 2 loại dung dịch rửa PEG là dung dịch Ca2+ và dung dịch nuụi (24a) với số lần rửa khỏc nhau;
1 rửa + 1 nuụi (I) 2 rửa + 1 nuụi (II)
Hỡnh 12: Ảnh hưởng của cỏc phương phỏp rửa dung hợp khỏc nhau tới chất lượng tế bào.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 60
Chỳ thớch:
I: rửa 1 lần bằng dung dịch rửa sau ủú rửa 1 lần bằng dung dịch nuụi. II: rửa 2 lần bằng dung dịch rửa sau ủú rửa 1 lần bằng dung dịch nuụi. III: rửa 1 lần bằng dung dịch rửa sau ủú rửa 2 lần bằng dung dịch nuụi. IV: rửa 2 lần bằng dung dịch rửa sau ủú rửa 2 lần bằng dung dịch nuụi. Sau dung hợp bổ sung 1ml mụi trường nuụi ta thấy cỏc cỏch rửa ủều sạch PEG, nhưng mỗi cỏch rửa lại cú sự khỏc nhau về số tế bào nguyờn vẹn và lượng tế bào bị vỡ (màng tế bào bị vỡ).
Nguyờn nhõn của hiện tượng này là:
- Dịch rửa Ca2+ cú tỏc dụng làm pha loóng PEG, giảm ủộ dớnh giữa cỏc tế bào và xỳc tỏc cho quỏ trỡnh rỏch màng sinh chất tại vựng tiếp giỏp 2 tế bào, liờn kết màng tế bào, nhưng ủể protoplast lõu trong dung dịch này sẽ gõy vỡ. Vỡ vậy, tỷ lệ tế bào bị vỡ và mất ủi trong quỏ trỡnh rửa tỷ lệ thuận với số lần rửa bằng dung dịch Ca2+.
- Sau khi rửa PEG bằng Ca2+ ở pH cao ta tiếp tục rửa bằng mụi trường nuụi. Rửa bằng mụi trường nuụi cú tỏc dụng làm pha loóng, rửa sạch PEG và dung dịch Ca2+ cũn sút lại ủể ủảm bảo nồng ủộ của mụi trường nuụi cấy. Mụi trường nuụi cũng là mụi trường ưu trương (ỏp suất thẩm thấu lớn) nờn protoplast sẽ căng trũn trong mụi trường này làm rỏch màng sinh chất tại vị trớ tiếp xỳc giữa 2 tế bào và mụi trường này cũng làm giảm ủộ kết dớnh giữa tế bào với ủĩa dung hợp. Do ủú lượng tế bào lơ lửng trong dịch rửa sẽ tăng và sẽ bị mất ủi trong quỏ trỡnh hỳt bỏ dịch rửa. Núi cỏch khỏc là số tế bào bị mất ủi tỷ lệ thuận với số lần rửa bằng mụi trường nuụi.
điều này ủược nhận thấy rừ qua cỏc cụng thức của thớ nghiệm:
Ở hai cụng thức III và IV với số lần rửa bằng mụi trường nuụi là 2 lần thỡ lượng tế bào cũn lại rất ớt chứng tỏ tế bào bị mất ủi trong quỏ trỡnh hỳt rửa nhiều. Nhưng trong hai cụng thức này thỡ cụng thức III lượng tế bào nguyờn
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 61
vẹn cũn lại sau quỏ trỡnh rửa là ớt nhất trong ủú lượng tế bào bị vỡ lại nhiều hơn.
So với cụng thức III và IV thỡ tế bào cũn lại của cụng thức I và II nhiều hơn. Vậy với phương phỏp rửa cú số lần rửa bằng mụi trường nuụi ớt hơn thỡ tỏ ra hiệu quả hơn so với cỏc phương phỏp cú số lần rửa bằng mụi trường nuụi nhiều. Nhưng ở hai cụng thức I và II lại cú sự khỏc nhau về tỷ lệ tế bào bị vỡ, cụng thức II cú số tế bào bị vỡ cao hơn với cụng thức 1. Như vậy cụng thức 1 tỏ ra hiệu quả hơn so với cỏc phương phỏp rửa khỏc. điều này cũng ủược thể hiện qua bảng số liệu sau:
Bảng 10: Số tế bào nguyờn vẹn và bị vỡ sau dung hợp khi thay ủổi về cỏch rửa
Số tế bào Cụng thức
Số tế bào nguyờn vẹn Số tế bào vỡ
I 160 30
II 120 51
III 64 52
IV 74 24
Qua bảng số liệu ta thấy cụng thức I cho số tế bào nguyờn vẹn cao nhất là 160 tế bào và số tế bào bị vỡ 30 tế bào. Lượng tế bào bị vỡ của cụng thức I nhiều hơn so với cụng thức IV nhưng cụng thức IV lại cú số tế bào cũn lại ớt hơn. điều này cú thể thấy cỏch rửa I cho hiệu quả cao nhất và là phương phỏp rửa phự hợp.
Như vậy rửa sạch PEG, chỳng tụi sử ,dụng cỏch rửa: rửa lần I bằng dung dịch Ca2+ (trong 20 phỳt) và rửa lần II bằng mụi trường nuụi 24a (trong 20 phỳt).
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 62
4.7.1.5. Thớ nghiệm 5: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng ủộ Ca2+ bổ sung vào mụi trường nuụi cấy
Trong cỏc nghiờn cứu dung hợp trờn, cỏc protoplast sau dung hợp ủược nuụi cấy trờn 24a hoặc 24b (hai mụi trường thớch hợp nhất cho mụi trường cấy tại tạo thành và phõn chia protoplast) nhưng chỳng tụi ủó vấp phải khú khăn như lượng tế bào vỡ tăng lờn sau 2-3 ngày nuụi cấy, sự phõn chia của cỏc tổ hợp lai sau dung hợp xảy ra khụng ủồng ủều và quỏ trỡnh này xảy ra với tốc ủộ chậm, thời gian phõn chia ngắn.
Theo quan ủiểm của chỳng tụi nồng ủộ Ca2+ trong mụi trường nuụi cấy protoplast sau dung hợp bằng hoỏ chất PEG ngoài tỏc dụng kớch thớch tỏi tạo thành tế bào, kớch thớch tế bào phõn chia, Ca2+ cũn cú tỏc dụng hấp thu PEG cũn sút lại sau quỏ trỡnh rửa trỏnh gõy ủộc cho tế bào. Vỡ vậy việc tỡm ra nồng ủộ Ca2+ thớch hợp ủể bổ sung vào mụi trường nuụi cấy tổ hợp protoplast sau dung hợp là rất cần thiết.
Hỡnh 13: Sự phõn chia của protoplast của dũng B208 trờn cỏc mụi trường nuụi cú bổ sung nồng ủộ Ca2+ khỏc nhau. 1000mg/l Ca2+ 2000mg/l Ca2+ 1500mg/l Ca2+
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 63
Chỳng tụi tiến hành bổ sung Ca (NO3)2 ở cỏc nồng ủộ khỏc nhau vào mụi trường nuụi cấy của B208, sau 4 ngày thỡ thu ủược hỡnh ảnh phõn chia:
Bảng 11: Sự phõn chia của protoplast của dũng B208 trờn cỏc mụi trường nuụi cú bổ sung nồng ủộ Ca2+ khỏc nhau. Nồng ủộ Ca2+ Mụi trường 500mg/l Ca2+ 1000mg/l Ca2+ 1500mg/l Ca2+ 2000mg/l Ca2+ 24a 4 4 2 3 24b 5 4 3 4
Trong thớ nghiệm 1 ta ủó xỏc ủịnh ủược hai mụi trường 24a và 24b là hai mụi trường thớch hợp nhất cho nuụi cấy protoplast. Tuy nhiờn trờn nền hai mụi trường này, ta thay ủổi nồng ủộ Ca2+ (bổ sung Ca (NO3)2) cho ta sự thay ủổi rừ rằng về thời gian phõn chia của cỏc tổ hợp lai dung hợp cũng như cải thiện chất lượng phõn chia của cỏc protoplast trờn hai mụi trường này.
- Cỏc protoplast phõn chia diễn ra nhanh, ủồng ủồng, tỷ lệ protoplast phõn chia cao.
- Mụi trường 24a thỡ cú sự khỏc biệt rừ rệt khi thay ủổi nồng ủộ Ca2+ và nồng ủộ Ca2+ ở 1500mg/1 cũng cho hiệu quả phõn chia cao nhất (chỉ sau 2 ngày nuụi cấy ủó cú hiện tượng phõn chia). Mặc dự nồng ủộ Ca2+ này trờn mụi trường 24b cho thời gian phõn chia lõu hơn so với 24a nhưng cỏc tế bào phõn chia ủồng ủều hơn.
- Ở nồng ủộ Ca2+ 500mg/1 và 1000mg/1 cho thời gian phõn chia chậm nhất (sau 4 ngày), cỏc tổ hợp sau dung hợp phõn chia khụng ủồng ủều, lượng tế bào bị vỡ sau 1 ngày nuụi cấy tăng so với thời ủiểm bắt ủầu nuụi cấy. điều này cú thể khẳng ủịnh thờm vai trũ của nồng ủộ Ca2 trong mụi trường nuụi cấy sau dung hợp.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 64
Hỡnh 14: Sự phõn chia của protoplast của dũng B208 sau 3ngày và sau 4 tuần nuụi cấy
Sau 4 tuần nuụi cấy trờn 2 mụi trường này thỡ protoplast vẫn phõn chia và hỡnh thành cỏc cụm tế bào cú kớch thước lớn. đõy là một bước tiến quan trọng, và cũng là bước ngoặt ủể chỳng tụi cú thể tiến hành bước tiếp theo ủú là chuyển sang mụi trường microcallus. Khỏc hẳn với cỏc nghiờn cứu trước ủõy cỏc tế bào phõn chia chỉ dừng lại ở mức phõn chia của từng protoplast, sau một thời gian nuụi cấy cỏc tế bào này cú hiện tượng chết hỡnh thành cỏc cặn xỏc tế bào.
Kết luận: Trờn hai mụi trường 24a và 24b cú bổ sung 1500mg/l Ca2+ là hai mụi trường thớch hợp ủể nuụi cấy protoplast sau dung hợp bằng hoỏ chất PEG.
Từ ủú chỳng tụi xõy dựng quy trỡnh dung hợp bằng PEG như sau:
24a sau 3 ngày 24b sau 3ngày
24b sau 4 tuần 24a sau 4 tuần
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 65 100 àl Hỗn hợp d d protoplast của 2 loài 25àl PEG 22,5%, 3 phỳt 1. Sau 3 phỳt rửa PEG 2. Rửa lần 1 bằng dd Ca2+ 20 phỳt, lần 2 bằng mt 24a ,20 phỳt 3. Nuụi trờn mt24a +1500mg/lCa2
Sau 7 ngày nuụi cấy
Bổsung 1-2 giọt mt
24a sau 7 ngày
Sau 3 tuần cấy chuyển
sang mt OX5
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 66
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN.
1. Sự thay ủổi tỷ lệ của M/C cú ảnh hưởng rừ rệt ủến hiệu suất tỏch Protoplast. Với mỗi dung dịch enzym khỏc nhau cho ta hiệu suất tỏch protoplast khỏc nhau: dung dịch enzym I phự hợp cho việc tỏch protoplast của cỏc giống A56, B186, H34, A41 Và B208, dung dịch enzym II phự hợp cho việc tỏch protoplast của giống H195, dung dịch enzym III phự hợp cho việc tỏch protoplast của giống A15, A16
2. đó xỏc ủịnh ủược thời gian ủ enzym thớch hợp cho từng giống (A15 là 14h, B186 là 15h, H195 là 14h, A56 là 14h, A16 là 14h).
3. đó tỡm ra phương phỏp khử trựng mụi trường nuụi thớch hợp nhất là phương phỏp lọc vụ trựng.
4. đó tỡm ra mụi trường nuụi thớch hơp ủể nuụi cấy protoplast sau tỏch là 24a, 24b.
5. đó tỡm ra mụi trường thớch hợp ủể kớch thớch tạo microcallus là mụi trường OX5.
6. đó xỏc ủịnh ủược phương thức cấy chuyển thớch hợp nhất ủể cỏc protoplast phõn chia và tạo microcallus là: Protoplast sau khi tỏch ủược nuụi cấy trờn mụi trường 24a hoặc 24b lỏng; cứ sau 1 tuần bổ sung thờm 1-2 giọt mụi trường nuụi; nuụi trong búng tối 24-25oC; Sau 3-4 tuần thỡ cấy chuyển sang mụi trường cứng OX5 microcallus (mỗi dũng khỏc nhau thỡ cú thời gian cấy chuểyn khỏc nhau).
7. ủó xỏc ủịnh ủược quy trỡnh của dung hợp protoplast bằng hoỏ chất PEG với cỏc thụng số sau:
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 67
- Nồng ủộ PEG dung hợp protoplast là 2,25%. - Thời gian ủ PEG: 3 phỳt
- Phương phỏp rửa PEG sau dung hợp: lần 1 rửa bằng dung dịch rửa Ca2 + lần 2 rửa bằng mụi trường nuụi.
- Sau dung hợp bằng hoỏ chất PEG thỡ protoplast sau dung hợp sẽ ủược nuụi trờn 24a và 24b cải tiến (bổ sung 1500mg Ca(NO3)2).
5.2 đề nghị
Do thời gian thực tập cú hạn, hơn nữa kỹ thuật tỏch và dung hợp protoplast là một lĩnh vực mới mẻ ở Vịờt Nam cho nờn cũn nhiều vấn ủề chỳng tụi chưa ủi sõu nghiờn cứu ủược. Vỡ vậy chỳng tụi ủưa ra ủề nghị:
- Tiếp tục tiến hành nuụi cấy, dung hợp bằng PEG ủể thu ủược con lai tỏi sinh.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 68
Tài liệu tham khảo
Phần tiếng việt
1. Hồ Hữu An (2005). Cây có củ và kỹ thuật thâm canh Ờ cây khoai tây. NXB Lao động xJ hội.
2. Đỗ Kim Chung (2003). Thị tr−ờng khoai tây ở Việt Nam. NXB văn hoá thông tin.
3. Nguyễn Quang Thạch (1993). Một số biện pháp khắc phục sự thoái hoá giống khoai tây (Solanmun tuberosum.L) ở Đồng bằng Bắc Bộ. Luận văn Phó tiến sỹ khoa học Nông nghiệp.
4. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Ph−ơng Thảo