microcallus tới khả năng hỡnh thành microcallus.
Sau một thời gian nuụi cấy những protoplast cú sức sống kộm sẽ bị chết, cũn những tế bào khoẻ sẽ tiếp tục phõn chia hỡnh thành cỏc cụm tế bào cỏc cụm TB này sẽ phỏt triển thành microcallus khi ủược chuyển sang mụi trường tạo microcallus.
Trong mụi trường nuụi cấy protoplast thỡ ỏp suất thẩm thấu cú vai trũ cực kỳ quan trọng, ngoài nhiệm vụ giữ cho protoplasl khụng bị vỡ ỏp suất thẩm thấu cũn ủảm bảo cho quỏ trỡnh phõn chia của tế bào diễn ra thuận lợi. Do ủú, nếu chuyển sớm protoplast, cỏc cụm tế bào chưa ủạt tới kớch thước nhất ủịnh sẽ khụng thể cảm ứng phõn chia tiếp ủể tạo Microcallus. Chớnh vỡ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 50
vậy chỳng tụi tiến hành xỏc ủịnh thời gian chuyển sang mụi trường OX5 thớch hợp cho từng dũng khoai tõy và sau cựng một thời gian (4 tuần), cỏc Microcallus ủều ủược hỡnh thành nhưng số microcallus hỡnh thành ở cỏc thớ nghiệm là khỏc nhau. ðếm số Microcallus hỡnh thành ta ủược bảng sau (cỏc microcallus cú kớch thước to và nhỡn ủược bằng mắt thường):
Bảng 8: Sự tạo thành Microcallus trờn mụi trường OX5
Thời gian Dũng
2 (tuần) 3 (tuần) 4 (tuần)
H1959/195 46 60 55 A56 48 64 51 H1929/34 54 74 68 B208 43 76 93 B186 49 70 91 A16 40 68 56 A15 50 66 52 A41 45 56 40
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 51
Nhận xột: Khi thay ủổi thời gian chuyển ta thấy cú sự khỏc biệt rừ rệt về số microcallus tạo thành.
- Cỏc protoplast sau 2 tuần nuụi cấy cú khả năng hỡnh thành microcallus. Trong khi ủú cỏc cụm tế bào phõn chia 3 – 4 tuần thỡ lượng microcallus tạo ra khỏ cao.
-Cỏc dũng khỏc nhau sẽ cú ủặc ủiểm sinh trưởng khỏc nhau hay khả năng phõn chia của Protoplast khỏc nhau:
ðối với dũng H1959/195, A56, A16, H1929/34, A41, A15 thỡ cỏc cụm tế bào phõn chia sau 3 tuần cho hiệu quả hỡnh thành microcallus cao nhất, dao ủộng từ 60 ủến 74 microcallus. Nhưng số callus tạo thành lại giảm ủi nếu kộo dài thời gian nuụi cấy tới 4 tuần, sở dĩ cú hiện tượng này là do mụi trường phõn chia khụng thể ủỏp ứng ủược nhu cầu dinh dưỡng cho tế bào phỏt triển ngày một tăng về kớch thước nờn cú hiện tượng tế bào bị chết.
ðối với dũng B208, B186 là hai dũng hỡnh thành nhiều Microcallus nhất và callus tạo ra nhiều nhất sau 4 tuần nuụi cấy phõn chia(B208:93 Microcallus, B186:91 Microcallus), lượng callus tạo ra sau 3 tuần nuụi cấy lại nhiều hơn số callus tạo ra sau 2 tuần nuụi cấy. Vỡ vậy ủối với dũng B208 và dũng B186 thỡ sau 4 tuần nuụi cấy phõn chia ta sẽ tiến hành chuyển sang mụi trường tạo microcallus khi ủú sẽ cho hiệu quả cao nhất.
- ðiều kiện ủể hỡnh thành Microcallus: tế bào phõn chia tới một kớch thước nhất ủịnh, cỏc tế bào này ủược sinh trưởng phỏt triển trờn một mụi trường cú ủủ ủiều kiện dinh dưỡng và cỏc yếu tố kớch thớch sinh trưởng. Nếu tiến hành chuyển quỏ sớm, Protoplast phõn chia chưa ủủ kớch thước thỡ lượng microcallus hỡnh thành ớt và lõu, cũn nếu ủể lõu tế bào sẽ chết (do khụng ủủ dinh dưỡng và cỏc chất kớnh thớch sinh trưởng) dẫn tới microcallus khụng hỡnh thành và nếu hỡnh thành thỡ microcallus sinh ra ớt và yếu (microcallus màu vàng).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 52
- ðối với dũng H1959/195, A56, H1929/34, A16, A41 và A15: Sau 3 tuần nuụi cấy protoplast thỡ cấy chuyển sang mụi trường OX5.
- ðối với cỏc dũng B208, B186: Sau 4 tuần nuụi cấy cấy chuyển.
Sau những thớ nghiệm trờn chỳng tụi rỳt ra phương thức cấy chuyển protopast như sau: Protoplast sau khi tỏch ủược nuụi cấy trờn mụi trường 24a hoặc 24b lỏng; Cứ sau 1 tuần bổ sung thờm 1 – 2 giọt mụi trường nuụi; nuụi trong búng tối ở 24 -25oC, sau 3 – 4 tuần thỡ chuyển sang mụi trường cứng (OX5) Microcallus.
4.7.Nghiờn cứu xõy dựng quy trỡnh dung hợp protoplast bằng hoỏ chất PEG.