A. tumefaciens
1.2.2.1. Agrobacterium và hiện tượng biến nạp gen vào thực vật.
Phương pháp chuyển gen vào cây trồng qua A. tumefaciens được xem
là phương pháp hữu hiệu với nhiều thành tựu đã đạt được, đặc biệt trên đối
tượng cây hai lá mầm. A. tumefaciens là vi khuẩn đất được biết đến như một
tác nhân gây bệnh ở thực vật. Chúng có khả năng gây nhiễm thực vật, tạo
khối u ở các cây chủ, chủ yếu là ở cây hai lá mầm [3].Cơ chế gây bệnh cho
thực vật của A. tumefaciens đã được hiểu rõ khi các nhà khoa học phát hiện ra
sự tồn tại của Ti-plasmid trong vi khuẩn và việc chuyển gen từ Ti-plasmid
này sang genome của thực vật [35][37]. Trên cơ sở cấu trúc và chức năng của
Ti-plasmid, các hướng nghiên cứu khai thác, sử dụng chúng làm vector để đưa các gen mong muốn vào tế bào và mô thực vật đã được thực hiện.
1.2.2.2. Cấu tạo và chức năng của Ti-plasmid
Ti-plasmid là một cấu trúc di truyền ngoài nhiễm sắc thể, có kích thước khoảng 200 kb. Đây là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong
tế bào như một đơn vị sao chép độc lập. Ở các chủng A. tumefaciens khác nhau, Ti-plasmid đều có 4 vùng. Trong đó, vùng T-DNA (DNA chuyển –
transfer-DNA) là vùng duy nhất được chuyển từ A. tumefaciens sang genome
của cây bị bệnh. Nghiên cứu vùng T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau, người ta thấy rằng T-DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn gọi là đoạn biên (T-DNA border sequence). Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật. Các Ti- plasmid có kích thước quá lớn nên không thể dùng làm vector, do vậy, các
vector nhỏ hơn đã được thiết kế cho phù hợp với thao tác in vitro như cắt bỏ
năng. Có hai hệ thống vector Ti-plasmid chuyển gen hiệu quả: Vector liên hợp (co-integrate vector) và vector hai nguồn (binary vector).
1.2.2.3. Thiết kế các Ti-plasmid tái tổ hợp mang gen có giá trị
Các Ti-plasmid thường được sử dụng trong công nghệ gen thực vật là những vector đơn giản mang các đặc tính chính: (i) Có khả năng sao chép độc lập và tích cực trong tế bào chủ; (ii) Có kích thước nhỏ, dễ nhận gen ngoại lai, dễ xâm nhập vào tế bào và dễ sao chép; (iii) Mang gen chỉ thị chọn lọc/ sàng lọc giúp dễ dàng phát hiện các tế bào tái tổ hợp chứa plasmid ở vi khuẩn cũng như trong thực vật; (iv) Tồn tại bền vững trong tế bào chủ; (v) Mang kết cấu gen có giá trị. Ngoài ra, các gen chỉ thị cũng như các gen quan tâm cần được điều khiển biểu hiện bởi promoter và terminator thích hợp [3].
Cùng với một số giống cây công nghiệp chính, ca cao đang là đối tượng được quan tâm trong cải biến di truyền nhằm tăng hơn nữa năng suất, chất lượng và tạo khả năng chống chịu bệnh, thích nghi với các điều kiện sinh thái. Hiện nay với mục đích thiết lập và tối ưu hóa quy trình chuyển gen kết hợp hệ
thống tái sinh in vitro từ phôi soma của ca cao, đã có một số nghiên cứu sử
dụng các gen chỉ thị như gen mã hóa protein phát huỳnh quang (Enhanced
Green Fluorescent Protein - EGFP) và gen chỉ thị nhuộm màu mô tế bào ß- Glucuronidase (GUS) chuyển vào cây ca cao thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens. Từ những nghiên cứu ban đầu trên các gen chỉ thị, sau này một
số nhóm nghiên cứu đã tiến hành các nghiên cứu chuyển một số gen đích vào cây ca cao [25], [34] [26], [36]. Các gen mã hóa protein có hoạt tính diệt côn
trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hóa chitinase là các gen đích có giá trị. Tương ứng với các gen này, các promoter cơ định như CaMV35S hay promoter đặc hiệu được chọn lựa để điều khiển biểu hiện gen