a. Chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens để biến nạp bằng xung
Formatted: Not Highlight
- Ngày 1:
Bước 1 Hút 100 µl dịch từ ống giữ chủng A. tumefaciens nuôi trong 3 ml
LB lỏng + rifampicin (50 µl/ml), nuôi lắc ở 280C qua đêm.
- Ngày 2:
Bước 2 Cấy vạch ra môi trường LB đặc + rifampicin (50 µl/ml), nuôi ở tủ
ấm 280C qua đêm.
Chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens để biến nạp bằng phương pháp
xung điện
- Ngày 3:
Bước 3 Nhặt 2 khuẩn lạc A. tumefaciens từ đĩa cấy vạch nuôi lắc 280C qua
đêm trong 2 ml môi trường LB lỏng + rifampicin (50 µl/ml) 6 giờ (từ 9 giờ đến 16 giờ).
Bước 4 Cấy chuyển 200 ml dịch nuôi vào 50 ml LB lỏng + rifampicin (50
µl/ml), nuôi lắc ở 280C qua đêm.
- Ngày 4:
Bước 5 Đo và chuẩn OD dịch nuôi A. tumefaciens cần đạt từ 0,5 – 1.
Bước 6 Chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm (đã làm lạnh), ủ trên đá 15 phút, ly tâm 5.000 v/p trong 20 phút để thu cặn tế bào.
Bước 7 Rửa cặn tế bào 3 lần bằng 10 ml HEPES 1 mM, pH 7; rửa 1 lần trong
10 ml glycerol 10%, ly tâm 5.000 v/p trong 10 phút mỗi lần rửa.
Bước 8 Cặn tế bào hòa tan trong 500 - 700 µl glycerol 10%.
Bước 9 Chia vào mỗi ống eppendorf 100 µl dịch tế bào, cất giữ ở -800C.
b. Biến nạp DNA vào tế bào A. tumefaciens bằng phương pháp xung
Bước 1 Để ống tế bào khả biến trên đá 30 phút.
Bước 2 Bổ sung 5 µl Ti-plasmid nồng độ 40 - 50 ng/µl vào ống tế bào khả
biến (Ti-plasmid đã được tinh sạch qua cột để loại bỏ hết các muối), để trên đá 10 phút.
Bước 3 Chuyển dịch tế bào khả biến đã bổ sung Ti-plasmid vào cuvet
xung điện (cuvet đã được làm sạch, khử trùng bằng cách chiếu đèn UV trực tiếp và để lạnh trên đá).
Bước 4 Thấm khô cuvet và xung điện ở 25 Ω; 2,5 V; 400 W.
Bước 5 Bổ sung 800 µl môi trường SOC vào cuvet, nuôi lắc ở 280C trong
2 giờ
Bước 6 Cấy trải ra đia môi trường LB + rifamicin (50 µl/ml) + kháng sinh
chọn lọc của vector và nuôi ở tủ 280C trong 2 ngày [[32]]. 2.2.7. Tách chiết DNA plasmid
Nguyên tắc: tế Tế bào E. coli chứa DNA plasmid cần tinh sạch được
nuôi cấy và nhân lên đến giai đoạn giữa pha log (12 - 16 giờ). Màng tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằng kiềm và chất tẩy mạnh (thành phần trong dung dịch I và II). DNA nhiễm sắc thể và protein được loại ra nhờ dung dịch III và ly tâm. DNA plasmid thu được sau quá trình kết tủa trong ethanol và ly tâm với tốc độ 14.000 v/p. DNA được hòa trong TE (Tris-Cl + EDTA) và tiến hành loại RNA. Hóa chất tách chiết DNA plasmid bao gồm: (1) Dung dịch I: 50 mM glucose; 25 mM Tris-Cl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0. Khử trùng, giữ ở
-40C; (2) dung dịch II: 2 N NaOH; 1% SDS. Pha mới trước khi sử dụng; (3)
Dung dịch III: 60 ml acetate K 5 M; 11,5 ml acetic acid; 28,5 ml H2O; (4) Dung môi loại protein : phenol; hỗn hợp phenol : chloroform : isoamylacohol
(25 : 24 : 1); chloroform : isoamylacohol (24 : 1); (5) 0,01 M TE pH 8,0 : 0,1 mM Tris-Cl pH 8,0; 0,01 mM EDTA pH 8,0.
a. Quy trình tách chiết DNA plasmid của E. coli
Bước 1 Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào E. coli trong 3 ml môi trường LB với
kháng sinh thích hợp ở 370C, 200 v/p.
Bước 2 Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy trên ở 6.000 v/p, 8 phút.
Bước 3 Hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 100 l dung dịch I để lạnh, giữ trong
đá 5 phút.
Bước 4 Bổ sung 200 l dung dịch II pha mới, đảo đầu ống eppendorf nhẹ
nhàng và giữ trên đá 10 phút.
Bước 5 Thêm 150 l dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3 - 5
phút.
Bước 6 Thêm 550 l phenol : chloroform, đảo đầu ống eppendorf và ly tâm ở 14.000 v/p, 15 phút; Hút dịch pha trên sang ống eppendorf mới và chiết tiếp bằng bước chloroform : isoamylalcohol.
Bước 7 Bổ sung 1 ml ethanol 100% và 10 l 3 M sodium acetate, để lạnh -
200C trong 3 giờ và ly tâm 14.000 v/p, 8 phút thu DNA.
Bước 8 Rửa cặn bằng 0,2 ml ethanol 70%, ly tâm 14.000 v/p, 3 phút, làm khô và hòa cặn trong 40 l 0,01 M TE, giữ ở -200C.
Bước 9 Bổ sung RNase vào mẫu DNA đến nồng độ cuối cùng là 100 µg/ ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ, chiết bằng phenol : chloroform, chloroform : isoamylalcohol và tủa lại DNA bằng ethanol.
Bước10 Nồng độ và độ sạch của DNA được xác định bằng phổ hấp thụ trên
máy quang phổ tử ngoại và điện di trên gel agarose 0.8% [32].
b. Quy trình tách chiết DNA plasmid của A. tumefaciens
Bước 1 Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào ở 280C, 36 giờ trên môi trường YEP có bổ sung kháng sinh.
Bước 2 Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy trên ở 12.000 v/p trong 10 phút, hòa
cặn tế bào nhẹ nhàng trong 1 ml dung dịch rửa pH 8,0 (0,5 M
NaCl; 50 mM Tris-Cl; 20 mM EDTA; 0,1% lyzozym), sau đó ly tâm ở 12.000 v/p, 40C, trong 1 phút.
Bước 3 Hòa cặn trong 100 µl dung dịch GTE (50 mM glucose; 25 mM
Tris - Cl; 10 mM EDTA pH 8,0), thêm 25 µl lysozyme 40 mg/ ml
pha trong GTE, trộn đều và ủ ở 370C trong 15 phút
Bước 4 Bổ sung 200 µl dung dịch II pha mới, đảo nhẹ đầu ống eppendorf,
ủ 10 phút ở 370C. Nếu mẫu không trong, ủ ở 500C, 5 phút.
Bước 5 Bổ sung 150 µl dung dịch 3M sodium acetate pH 5,2; lắc, giữ 10
phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 6 Ly tâm ở 12.000 v/p trong 5 phút, chuyển dịch pha trên sang ống
eppendorf mới, bổ sung 550 µl phenol : chloroform, ly tâm 12.000 v/p, trong 15 phút và tiếp tục chuyển pha trên sang
eppendorf mới. Bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối và giữ ở -200C trong 1
- 2 giờ.
2.2.8. Phân tích bằng enzyme hạn chế
Nguyên tắc: Các enzyme hạn chế là các endonuclease được phát hiện ở vi khuẩn. Chúng tham gia vào hệ thống bảo vệ của vi khuẩn, cắt DNA phage xâm nhiễm vào tế bảo vi khuẩn thành những đoạn nhỏ. Enzyme hạn chế có khả năng nhận biết đặc hiệu và cắt phân tử DNA tại trình tự nucleotide, từ đó tạo những đoạn DNA có kích thước xác định. Đặc tính này được sử dụng để phân tích DNA plasmid.
Thành phần phản ứng: Phản ứng cắt DNA với enzyme hạn chế có sự
tham gia của các thành phần: 1 l dung dịch đệm; 2 l DNA (~ 20 ng); 0,25
l enzyme hạn chế; 6,75 l H2O khử ion vô trùng. Hỗn hợp phản ứng được
trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (thường ở 370C, 2 giờ). Sản
phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8% [32].
2.2.9. Xác định trình tự
Nguyên tắc chung: Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân DNA như dNTP,
ddNTPs, DNA polymerase … Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản
phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại dNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại DNA để đọc trình tự bao gồm: mồi (thích hợp) 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 µl.
Chu trình nhiệt: Chu trình nhiệt cho PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 960C - 1 phút; (960C - 10 giây; 500C - 5 giây; 600C - 4
phút) x 25 chu kỳ. Sau đó, sản phẩm được giữ ở 40C.
Phân tích trình tự gen: Kết quả trình tự được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Bioedit; Seqscape 2.5. Từ các chương trình này tiến hành:
- So sánh trình tự của đoạn DNA với trình tự đã đăng ký trên Ngân hàng
gen GenBank.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ
HÓA CHITINASE (TcChi1) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pCB 301
Trong nghiên cứu này, các đoạn gen mã hóa chitinase liên quan được
sử dụng bao gồm: Vùng TcChi1-W: chứa toàn bộ trình tự gen TcChi1 với
vùng 5’ không dịch mã (5’ UTR), vùng tín hiệu TATA, ba exon mã hóa toàn bộ protein chitinase, hai intron, vùng tín hiệu poly(A) và vùng 3’ không dịch mã (3’ UTR) (từ vị trí 1 đến 1856 của trình tự U30324.1) (1856 bp). Vùng
TcChi1-U: chứa 33 bp của vùng 5’ UTR, ba exon mã hóa toàn bộ protein
chitinase, hai intron và 30 bp của vùng 3’ UTR (từ vị trí 444 đến 1666 của trình tự U30324.1) (1223 bp) [25][26]. Vùng TcChi1: chứa toàn bộ vùng
mang mã (từ vị trí 477 đến 1636 của trình tự U30324.1) (1159 bp).
Với mục đích tạo các vector biểu hiện thực vật khác nhau mang các đoạn gen này, chúng tôi đã xây dựng các chiến lược thiết kế vector phù hợp
trên cơ sở các vector gốc hiện có. Đối với gen mã hóa TcChi1, chúng tôi đã
lựa chọn hệ vector pCB301 với kích thước phân tử 5561 bp và được cải tiến
làm vector hai nguồn với một số đặc tính: (1) Dễ dàng nhân trong vi khuẩn E.
coli với số lượng bản sao lớn; (2) Có thể sử dụng để chuyển vào tế bào A. tumefaciens; (3) Mang gen kháng kanamycin dùng cho chọn lọc vi khuẩn và
chọn lọc thực vật; (4) Mang chỉ thị sàng lọc xanh trắng nhờ biểu hiện hoặc không biểu hiện β-galactosidase.
Formatted: Font: 15 pt
3.1.1. Sơ đồ thí nghiệm
Việc tạo vector biểu hiện thực vật pCB301 mang gen mã hóa TcChi1
dự kiến được thực hiện qua các bước:
(1) Tạo vector trung gian pRTRA7/3 mang gen mã hóa TcChi1: Gen mã hóa TcChi1 được nhân lên từ vector tạo dòng pJET1.2+TcChi1-W và xử lý bằng enzyme hạn chế BglII và NotI; Vector pRTRA7/3 gốc được xử lý bằng enzyme hạn chế BamHI và NotI; Lai hai sản phẩm tinh sạch và chọn
dòng tái tổ hợp.
(2) Tạo vector biểu hiện thực vật pCB301 mang gen mã hóa TcChi1: Cấu trúc gen mã hóa TcChi1 trong vector trung gian pRTRA7/3+TcChi1 được xử lý bằng enzyme hạn chế HindIII; Vector pCB301 gốc được xử lý bằng
enzyme hạn chế tương ứng; Lai hai sản phẩm tinh sạch và chọn dòng tái tổ hợp.
Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa
TcChi1
3.1.2. Nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1 từ dòng pJET+TcChi1-
W/1 bằng kỹ thuật PCR
Sau khi gen mã hóa chitinase TcChi1-W được tạo dòng trong vector
pJET 1.2 và được xác định trình tự hoàn chỉnh, chúng tôi đã sử dụng khuôn
mẫu là plasmid tái tổ hợp dòng số 1 (pJET+TcChi1-W/1) và cặp mồi
TcChi1_F và R để nhân đoạn gen mã hóa TcChi1 có kích thước 1159 bp (chỉ
chứa vùng mang mã). Sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1 được trình bày trên
hình 3.2A. Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR rất đặc hiệu, có kích thước khoảng 1,1 kb đúng như tính toán lý thuyết.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1 và sản phẩm xử lý enzyme hạn chế các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8% A: M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1 B: M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2-3. pJET+TcChi1/1, 2, 4/BglII + NotI
1.15 6 3 1 kb M 1 2 3 2.9 1.15 6 3 1 kb A A2 B
Sản phẩm PCR chứa đoạn gen TcChi1 sau đó cũng được tạo dòng trong
vector pJET1.2 để lưu giữ phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. Các plasmid tái tổ
hợp được kiểm tra bằng enzyme hạn chế BglII và NotI. Các plasmid mang sản
phẩm PCR mong muốn khi xử lý bằng hai enzyme hạn chế này sẽ xuất hiện 2 băng. Một băng có kích thước ~ 2,9 kb (tương ứng với kích thước của vector pJET1.2) và một băng có kích thước 1,15 kb (tương ứng với kích thước của gen
mã hóa TcChi1 là 1159 bp). Kết quả trên hình 3.2B cho thấy sản phẩm xử lý
enzyme hạn chế các plasmid thu được hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết, chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc tạo các vector tạo dòng pJET1.2 tái
tổ hợp mang TcChi1.
3.1.3. Tạo vector trung gian pRTRA + TcChi1 tái tổ hợp
Để có thể biểu hiện trong thực vật, gen mã hóa TcChi1 cần được đặt
dưới sự điều khiển của promoter và terminator thích hợp. Trong nghiên cứu
này, gen mã hóa TcChi1 được đưa vào vector trung gian để tạo cấu trúc hoàn
chỉnh (bao gồm promoter, gen đích và terminator). Sau đó, cấu trúc hoàn chỉnh của gen được chuyển vào vector biểu hiện thực vật gốc pCB301. Vector trung gian được lựa chọn là pRTRA. Vector pRTRA có mang các đặc điểm ưu việt như chứa các vùng trình tự quan trọng: CaMV35S promoter, signal peptide hướng protein vào lưới nội chất, vùng mã hóa cho chuỗi peptide cMyc-KDEL liền kề với vùng terminator tạo thuận lợi cho việc kiểm tra sự biểu hiện gen.
a. Xử lý vector pRTRA và gen mã hóa TcChi1
Xử lý bằng enzyme hạn chế: Theo sơ đồ thiết kế trên hình : Vector pRTRA (chứa CaMV35S-Sp-M1-cMyc-KDEL) kích thước 4247 bp được xử
bp). Đồng thời, vector pJET+TcChi1/1 cũng được xử lý bằng BglII + NotI để thu được đoạn gen mã hóa TcChi1 dạng đoạn BglII – NotI. Sau khi được xử lý, vector pRTRA mở vòng và gen mã hóa TcChi1-U có các đầu cắt tương
thích (hình 3.3).
Hình 3.3. Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NotI
Loại đầu 5’ phosphate của vector: Nhằm tránh hiện tượng tự đóng vòng, vector sau khi cắt hoàn toàn bằng enzyme hạn chế thường được loại
nhóm phosphate ở đầu 5' bằng phản ứng loại phosphate theo phương pháp đã
mô tả. Thành phần phản ứng như sau: Buffer CIAP: 9 µl, Vector đã mở vòng:
60 µl, enzyme CIAP: 2 µl, H2O: 19 µl. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 370C
trong 1 giờ tạo nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của enzyme CIAP, sau đó
hỗn hợp được chuyển sang nhiệt độ 700C trong 5 phút để ngừng hoạt tính của
enzyme thừa.
Thu hồi vector pRTRA và gen mã hóa TcChi1 tinh sạch: Vector pRTRA sau khi xử lý enzyme và loại phosphate, gen mã hóa TcChi1 sau xử
lý enzyme đã được tinh sạch. Để có thể thu nhận được đoạn vector cũng như gen ở dạng tinh sạch, chúng tôi đã tiến hành điện di các sản phẩm cắt trên gel
Comment [LTH1]: Chuyển sang phần phương pháp
agarose và thu một băng duy nhất với nồng độ đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Thiết kế vector tái tổ hợp trung gian pRTRA + TcChi1
Để thuận lợi cho việc xác định trình tự và sử dụng gen mã hóa chitinase trong các nghiên cứu biểu hiện sau này, sản phẩm PCR chứa đoạn
gen mã hóa TcChi1 đã được chúng tôi tạo dòng trong vector pRTRA. Do
enzyme BamHI (GGATCC) và BglII (AGATCT) có sự tương đồng về điểm cắt nên đoạn gen mã hóa TcChi1 có thể được gắn vào vector pRTRA (thay
thế gen M1) (Hình 3.4).
Hình 3.4. Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pRTRA-TcChi1
Sản phẩm gen mã hóa TcChi1 và vector pRTRA sau khi xử lý enzyme đã được lai với nhau và biến nạp vào E. coli chủng DH10b. Các tế bào khả
biến sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh
0
Formatted: Left
khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có chứa plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang các đoạn DNA đã nhân được bằng kỹ thuật PCR hay không, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra (hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kết quả chọn lọc các plasmid pRTRA tái tổ hợp trên gel agarose 0.8%
1. Vector gốc pRTRA; 2-3-4-5. Vector tái tổ hợp pRTRA+TcChi1