Để có thể biểu hiện trong thực vật, gen mã hóa TcChi1 cần được đặt
dưới sự điều khiển của promoter và terminator thích hợp. Trong nghiên cứu
này, gen mã hóa TcChi1 được đưa vào vector trung gian để tạo cấu trúc hoàn
chỉnh (bao gồm promoter, gen đích và terminator). Sau đó, cấu trúc hoàn chỉnh của gen được chuyển vào vector biểu hiện thực vật gốc pCB301. Vector trung gian được lựa chọn là pRTRA. Vector pRTRA có mang các đặc điểm ưu việt như chứa các vùng trình tự quan trọng: CaMV35S promoter, signal peptide hướng protein vào lưới nội chất, vùng mã hóa cho chuỗi peptide cMyc-KDEL liền kề với vùng terminator tạo thuận lợi cho việc kiểm tra sự biểu hiện gen.
a. Xử lý vector pRTRA và gen mã hóa TcChi1
Xử lý bằng enzyme hạn chế: Theo sơ đồ thiết kế trên hình : Vector pRTRA (chứa CaMV35S-Sp-M1-cMyc-KDEL) kích thước 4247 bp được xử
bp). Đồng thời, vector pJET+TcChi1/1 cũng được xử lý bằng BglII + NotI để thu được đoạn gen mã hóa TcChi1 dạng đoạn BglII – NotI. Sau khi được xử lý, vector pRTRA mở vòng và gen mã hóa TcChi1-U có các đầu cắt tương
thích (hình 3.3).
Hình 3.3. Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NotI
Loại đầu 5’ phosphate của vector: Nhằm tránh hiện tượng tự đóng vòng, vector sau khi cắt hoàn toàn bằng enzyme hạn chế thường được loại
nhóm phosphate ở đầu 5' bằng phản ứng loại phosphate theo phương pháp đã
mô tả. Thành phần phản ứng như sau: Buffer CIAP: 9 µl, Vector đã mở vòng:
60 µl, enzyme CIAP: 2 µl, H2O: 19 µl. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 370C
trong 1 giờ tạo nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của enzyme CIAP, sau đó
hỗn hợp được chuyển sang nhiệt độ 700C trong 5 phút để ngừng hoạt tính của
enzyme thừa.
Thu hồi vector pRTRA và gen mã hóa TcChi1 tinh sạch: Vector pRTRA sau khi xử lý enzyme và loại phosphate, gen mã hóa TcChi1 sau xử
lý enzyme đã được tinh sạch. Để có thể thu nhận được đoạn vector cũng như gen ở dạng tinh sạch, chúng tôi đã tiến hành điện di các sản phẩm cắt trên gel
Comment [LTH1]: Chuyển sang phần phương pháp
agarose và thu một băng duy nhất với nồng độ đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Thiết kế vector tái tổ hợp trung gian pRTRA + TcChi1
Để thuận lợi cho việc xác định trình tự và sử dụng gen mã hóa chitinase trong các nghiên cứu biểu hiện sau này, sản phẩm PCR chứa đoạn
gen mã hóa TcChi1 đã được chúng tôi tạo dòng trong vector pRTRA. Do
enzyme BamHI (GGATCC) và BglII (AGATCT) có sự tương đồng về điểm cắt nên đoạn gen mã hóa TcChi1 có thể được gắn vào vector pRTRA (thay
thế gen M1) (Hình 3.4).
Hình 3.4. Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pRTRA-TcChi1
Sản phẩm gen mã hóa TcChi1 và vector pRTRA sau khi xử lý enzyme đã được lai với nhau và biến nạp vào E. coli chủng DH10b. Các tế bào khả
biến sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh
0
Formatted: Left
khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có chứa plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang các đoạn DNA đã nhân được bằng kỹ thuật PCR hay không, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra (hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kết quả chọn lọc các plasmid pRTRA tái tổ hợp trên gel agarose 0.8%
1. Vector gốc pRTRA; 2-3-4-5. Vector tái tổ hợp pRTRA+TcChi1
Các plasmid sau tách chiết được tiến hành chọn lọc bằng enzyme hạn
chế BamHI. Vì trong gen mã hóa TcChi1 chỉ có một điểm cắt của BamHI và điểm cắt của BamHI trên vector pRTRA không còn tồn tại do lai với BglII trên gen TcChi1 nên sản phẩm xử lý enzyme các plasmid tái tổ hợp pRTRA+TcChi1 theo tính toán lý thuyết là một băng có kích thước 4,6 kb.
Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme này cho thấy đoạn DNA 4,6 kb (Hình
3.6) đã xuất hiện, chứng tỏ đoạn gen mã hóa TcChi1 đã được ghép nối vào vector pRTRA tạo cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kết quả tạo pRTRA+TcChi1
trên gel agarose 0,8%
M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 2. Plasmid pRTRA+TcChi1/2/BamHI 4. Plasmid pRTRA+TcChi1/4/BamHI