Việc tạo vector biểu hiện thực vật pCB301 mang gen mã hóa TcChi1
dự kiến được thực hiện qua các bước:
(1) Tạo vector trung gian pRTRA7/3 mang gen mã hóa TcChi1: Gen mã hóa TcChi1 được nhân lên từ vector tạo dòng pJET1.2+TcChi1-W và xử lý bằng enzyme hạn chế BglII và NotI; Vector pRTRA7/3 gốc được xử lý bằng enzyme hạn chế BamHI và NotI; Lai hai sản phẩm tinh sạch và chọn
dòng tái tổ hợp.
(2) Tạo vector biểu hiện thực vật pCB301 mang gen mã hóa TcChi1: Cấu trúc gen mã hóa TcChi1 trong vector trung gian pRTRA7/3+TcChi1 được xử lý bằng enzyme hạn chế HindIII; Vector pCB301 gốc được xử lý bằng
enzyme hạn chế tương ứng; Lai hai sản phẩm tinh sạch và chọn dòng tái tổ hợp.
Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pCB301 mang gen mã hóa
TcChi1
3.1.2. Nhân đoạn gen mã hóa chitinase TcChi1 từ dòng pJET+TcChi1-
W/1 bằng kỹ thuật PCR
Sau khi gen mã hóa chitinase TcChi1-W được tạo dòng trong vector
pJET 1.2 và được xác định trình tự hoàn chỉnh, chúng tôi đã sử dụng khuôn
mẫu là plasmid tái tổ hợp dòng số 1 (pJET+TcChi1-W/1) và cặp mồi
TcChi1_F và R để nhân đoạn gen mã hóa TcChi1 có kích thước 1159 bp (chỉ
chứa vùng mang mã). Sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1 được trình bày trên
hình 3.2A. Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR rất đặc hiệu, có kích thước khoảng 1,1 kb đúng như tính toán lý thuyết.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa TcChi1 và sản phẩm xử lý enzyme hạn chế các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8% A: M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1 B: M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2-3. pJET+TcChi1/1, 2, 4/BglII + NotI
1.15 6 3 1 kb M 1 2 3 2.9 1.15 6 3 1 kb A A2 B
Sản phẩm PCR chứa đoạn gen TcChi1 sau đó cũng được tạo dòng trong
vector pJET1.2 để lưu giữ phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. Các plasmid tái tổ
hợp được kiểm tra bằng enzyme hạn chế BglII và NotI. Các plasmid mang sản
phẩm PCR mong muốn khi xử lý bằng hai enzyme hạn chế này sẽ xuất hiện 2 băng. Một băng có kích thước ~ 2,9 kb (tương ứng với kích thước của vector pJET1.2) và một băng có kích thước 1,15 kb (tương ứng với kích thước của gen
mã hóa TcChi1 là 1159 bp). Kết quả trên hình 3.2B cho thấy sản phẩm xử lý
enzyme hạn chế các plasmid thu được hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết, chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc tạo các vector tạo dòng pJET1.2 tái
tổ hợp mang TcChi1.
3.1.3. Tạo vector trung gian pRTRA + TcChi1 tái tổ hợp
Để có thể biểu hiện trong thực vật, gen mã hóa TcChi1 cần được đặt
dưới sự điều khiển của promoter và terminator thích hợp. Trong nghiên cứu
này, gen mã hóa TcChi1 được đưa vào vector trung gian để tạo cấu trúc hoàn
chỉnh (bao gồm promoter, gen đích và terminator). Sau đó, cấu trúc hoàn chỉnh của gen được chuyển vào vector biểu hiện thực vật gốc pCB301. Vector trung gian được lựa chọn là pRTRA. Vector pRTRA có mang các đặc điểm ưu việt như chứa các vùng trình tự quan trọng: CaMV35S promoter, signal peptide hướng protein vào lưới nội chất, vùng mã hóa cho chuỗi peptide cMyc-KDEL liền kề với vùng terminator tạo thuận lợi cho việc kiểm tra sự biểu hiện gen.
a. Xử lý vector pRTRA và gen mã hóa TcChi1
Xử lý bằng enzyme hạn chế: Theo sơ đồ thiết kế trên hình : Vector pRTRA (chứa CaMV35S-Sp-M1-cMyc-KDEL) kích thước 4247 bp được xử
bp). Đồng thời, vector pJET+TcChi1/1 cũng được xử lý bằng BglII + NotI để thu được đoạn gen mã hóa TcChi1 dạng đoạn BglII – NotI. Sau khi được xử lý, vector pRTRA mở vòng và gen mã hóa TcChi1-U có các đầu cắt tương
thích (hình 3.3).
Hình 3.3. Các vị trí nhận biết của enzyme BamHI và NotI
Loại đầu 5’ phosphate của vector: Nhằm tránh hiện tượng tự đóng vòng, vector sau khi cắt hoàn toàn bằng enzyme hạn chế thường được loại
nhóm phosphate ở đầu 5' bằng phản ứng loại phosphate theo phương pháp đã
mô tả. Thành phần phản ứng như sau: Buffer CIAP: 9 µl, Vector đã mở vòng:
60 µl, enzyme CIAP: 2 µl, H2O: 19 µl. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 370C
trong 1 giờ tạo nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của enzyme CIAP, sau đó
hỗn hợp được chuyển sang nhiệt độ 700C trong 5 phút để ngừng hoạt tính của
enzyme thừa.
Thu hồi vector pRTRA và gen mã hóa TcChi1 tinh sạch: Vector pRTRA sau khi xử lý enzyme và loại phosphate, gen mã hóa TcChi1 sau xử
lý enzyme đã được tinh sạch. Để có thể thu nhận được đoạn vector cũng như gen ở dạng tinh sạch, chúng tôi đã tiến hành điện di các sản phẩm cắt trên gel
Comment [LTH1]: Chuyển sang phần phương pháp
agarose và thu một băng duy nhất với nồng độ đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Thiết kế vector tái tổ hợp trung gian pRTRA + TcChi1
Để thuận lợi cho việc xác định trình tự và sử dụng gen mã hóa chitinase trong các nghiên cứu biểu hiện sau này, sản phẩm PCR chứa đoạn
gen mã hóa TcChi1 đã được chúng tôi tạo dòng trong vector pRTRA. Do
enzyme BamHI (GGATCC) và BglII (AGATCT) có sự tương đồng về điểm cắt nên đoạn gen mã hóa TcChi1 có thể được gắn vào vector pRTRA (thay
thế gen M1) (Hình 3.4).
Hình 3.4. Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pRTRA-TcChi1
Sản phẩm gen mã hóa TcChi1 và vector pRTRA sau khi xử lý enzyme đã được lai với nhau và biến nạp vào E. coli chủng DH10b. Các tế bào khả
biến sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh
0
Formatted: Left
khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có chứa plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang các đoạn DNA đã nhân được bằng kỹ thuật PCR hay không, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra (hình 3.5).
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kết quả chọn lọc các plasmid pRTRA tái tổ hợp trên gel agarose 0.8%
1. Vector gốc pRTRA; 2-3-4-5. Vector tái tổ hợp pRTRA+TcChi1
Các plasmid sau tách chiết được tiến hành chọn lọc bằng enzyme hạn
chế BamHI. Vì trong gen mã hóa TcChi1 chỉ có một điểm cắt của BamHI và điểm cắt của BamHI trên vector pRTRA không còn tồn tại do lai với BglII trên gen TcChi1 nên sản phẩm xử lý enzyme các plasmid tái tổ hợp pRTRA+TcChi1 theo tính toán lý thuyết là một băng có kích thước 4,6 kb.
Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme này cho thấy đoạn DNA 4,6 kb (Hình
3.6) đã xuất hiện, chứng tỏ đoạn gen mã hóa TcChi1 đã được ghép nối vào vector pRTRA tạo cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kết quả tạo pRTRA+TcChi1
trên gel agarose 0,8%
M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 2. Plasmid pRTRA+TcChi1/2/BamHI 4. Plasmid pRTRA+TcChi1/4/BamHI
3.1.4. Thiết kế vào tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase chitinase chitinase
a. Xử lý vector pCB301 và cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL
Xử lý bằng enzyme hạn chế: Vector pCB301 và cấu trúc
2 4 M
6 3 1 4.6
Formatted: Indent: First line: 0" Formatted Table
xử lý bằng enzyme này, vector pCB301 được mở vòng và cấu trúc
CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL có các đầu cắt tương thích (Hình 3.7).
Hình 3.7. Các vị trí nhận biết của enzyme HindIII
Thu hồi vector pCB301 (đoạn DNA có kích thước 5.56 kb) và cấu
trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL tinh sạch: Để có thể thu nhận được
vector cũng như gen đã xử lý ở dạng tinh sạch, chúng tôi đã tiến hành điện di các sản phẩm cắt trên gel agarose và thu băng quan tâm với nồng độ đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang gen mã hóa TcChi1
Trên cơ sở cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL đã thiết kế và
vector biểu hiện thực vật gốc pCB301, chúng tôi đã tiến hành tạo plasmid tái
tổ hợp pCB301 mang gen mã hóa TcChi1 dưới sự điều khiển của CaMV35S
Formatted: Danish Formatted: Normal
Formatted: Normal
promoter. Vùng MCS của pRTRA có vị trí cắt của enzyme HindIII, do vậy, toàn bộ cấu trúc gen CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL kích thước ~ 2 kb từ vector pRTRA+TcChi1 được chúng tôi đưa vào vector pCB301 dưới dạng đoạn HindIII tạo vector tái tổ hợp pCB301+TcChi1, kích thước ~ 8 kb. Cấu
trúc gen và sơ đồ thiết kế được trình bày trên hình 3.8.
Hình 3.8. Các cấu trúc gen và sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1
Comment [LTTH2]: Chỉnh lại Sơ đồ thiết kế pCB301 cho chuẩn hơn
Formatted: Indent: First line: 0"
Formatted: Centered, Level 1, Indent: First line: 0"
Hỗn hợp lai giữa vector pCB301 và cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc
-KDEL có sự tham gia của enzyme nối T4 ligase được ủ ở 140C qua đêm để
đảm bảo nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme hoạt động. Sản phẩm của phản
ứng lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli bằng phương pháp sốc
nhiệt, các tế bào biến nạp được sàng lọc trên môi trường kháng sinh kanamycin.
c. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp pCB301 mang gen TcChi1
Chúng tôi đã thu được một số khuẩn lạc phát triển trên môi trường sàng lọc và tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình đã được trình bày ở phần phương pháp. Các plasmid sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8%. Kết quả được trình bày trên hình 3.9.
Hình 3.9. Hình ảnh điện di chọn lọc các plasmid tái tổ hợp pCB301
1. Vector tái tổ hợp pCB301 mang gen mã hóa TcChi1; 2. Vector pCB301
Sau khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmid kích thước lớn hơn
pCB301, chúng tôi đã xử lý enzyme hạn chế HindIII dòng plasmid pCB301+TcChi1/1. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm xử lý enzyme này sẽ
là hai băng. Một băng có kích thước ~ 2 kb tương ứng với kích thước của cấu
trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL và một băng có kích thước ~ 6 kb
tương ứng với kích thước của vector pCB301. Kết quả trên hình 3.10 (giếng 2) hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết, chứng tỏ chúng tôi đã đưa được
cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cMyc-KDEL vào vector pCB301 và tạo được plasmid tái tổ hợp pCB301+TcChi1.
Vùng gen mã hóa TcChi1 trong vector biểu hiện pCB301+TcChi1/1 sau
đó được xác định trình tự để đảm bảo không có sự thay đổi trình tự nucleotide trong quá trình nhân và tạo dòng gen. Kết quả xác định và so sánh trình tự gen
mã hóa TcChi1 với gen mã hóa TcChi1-W đã xác định trình tự trước đó cho
thấy hoàn toàn không có sự sai khác về trình tự gen.
M 1 2 1,0- 3,0- 6,0- -2,0 kb
Hình 3.10. Điện di sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel agarose 0,8%
M. Thang DNA chuẩn 1 kb;
1. pCB301/HindIII; 2. pCB301+TcChi1/1/HindIII
3.1.5. Tạo chủng A. tumefaciens mang Ti-plasmid pCB301+TcChi1 tái tổ
hợp bằng phương pháp xung điện
Phương pháp chuyển gen trực tiếp vào tế bào A. tumefaciens qua xung
điện hay sốc nhiệt đều cần tạo tế bào khả biến. Mặc dù phương pháp sốc nhiệt tiến hành khá đơn giản nhưng hiệu quả tương đối thấp nên với các thiết bị của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen của Viện Công nghệ sinh học, chúng tôi đã sử dụng phương pháp xung điện để chuyển Ti-plasmid mang các
cấu trúc gen thiết kế được vào tế bào A. tumefaciens.
Để có tế bào khả biến A. tumefaciens, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy
lại các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch đặc LB trước khi cấy chuyển liên tiếp hai lần sang môi trường lỏng có bổ sung 0,1% glucose.
Sau khi xử lý bằng xung điện (ở điều kiện 25 F; 400 ; 2,42 kV; 8 -
10 ms), mẫu được phục hồi ngay trong môi trường tăng cường. Trên các môi trường chọn lọc (ví dụ: LB + kanamycin + rifamicin + chloromycin cho chủng EHA105) sau hai ngày nuôi cấy, chúng tôi đã thu được khá nhiều khuẩn lạc.
Các khuẩn lạc A. tumefaciens tạo được nhờ xung điện có chứa Ti-
plasmid tái tổ hợp được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường
đặc hiệu, tách chiết DNA plasmid, biến nạp trở lại tế bào E. coli và tiến hành
các thí nghiệm phân tích phân tử tiếp theo. Sở dĩ cần phải thực hiện bước biến
của plasmid tái tổ hợp này trong tế bào A. tumefaciens rất ít, không đủ để tiến
hành các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen đưa vào.
Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành PCR. Đây là phương pháp đơn giản cho phép khẳng định và xác định chính xác cấu trúc của plasmid tái tổ hợp
được biến nạp vào A. tumefaciens. Giống như các PCR thông thường, hiệu
quả phản ứng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: trình tự mồi, nồng độ Mg++, nhiệt độ và thời gian của các chu kỳ phản ứng.
Với các cặp mồi đã thiết kế, chúng tôi đã tiến hành nhân đoạn các đoạn
gen TcChi1 ở cấu trúc gen mới thiết kế được sử dụng DNA khuôn là plasmid tái tổ hợp tách chiết từ tế bào A. tumefaciens. Kết quả PCR xuất hiện băng 1.15 kb là kích thước của gen TcChi1 (Hình 3.11). Như vậy, chúng tôi đã chuyển được plasmid tái tổ hợp pCB301+TcChi1 vào trong tế bào A.
tumefaciens chủng EHA105 và LBA 4404 (Bảng 3.1). Các dòng sau biến nạp
được chúng tôi lưu giữ dùng làm nguyên liệu để chuyển vào cây trồng.
1 3 6 1 M 2 1,15 kb Formatted: Centered
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1 từ chủng
vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp trên gel agarose 0.8%
M. Thang DNA chuẩn 1kb; ;
1. Sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1 chủng EHA 105
2. Sản phẩm PCR gen mã hóa TcChi1 chủng LBA 4404
Bảng 3.1. Thông tin về các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang vector pCB301+TcChi1
pCB301+TcChi1 Vector gốc pCB301 Kết cấu gen quan tâm CaMV35S+TcChi1+NOS Chỉ thị chọn lọc trong vi khuẩn E. coli hay A. tumefaciens Kanamycin 50 µg/ml Chỉ thị chọn lọc trong thực vật Kanamycin 50 µg/ml Cặp primer xác định sự có mặt của gen * Cặp primer sử dụng để PCR xác định sự có mặt của gen TcChi1: TcChi1_F: 5'- tatccaagatctatgagctttcgggccttg-3' TcChi1_R: 5'- acactaaagcggccgcgctacattgagtcca-3' Kích thước của sản phẩm PCR: 1159 kb Nhiệt độ nóng chảy cho PCR: 550C
Chu trình nhiệt nhân gen TcChi1: (950C: 5 phút; 950C: 1 phút; 550C: 1 phút; 720C: 1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 720C: 10 phút và kết thúc ở 40C
Enzyme cắt kiểm tra
Sử dụng RE HindIII cắt kiểm tra – kích thước đoạn DNA
thu được 6 kb + 2 kb
Formatted: Font: Not Italic Formatted: Font: Not Italic
pCB301+TcChi1
Ký hiệu chủng vi khuẩn tái tổ hợp
EHA105: pCB301+TcChi1 (A. tumefaciens chủng
EHA105)
LBA4404: pCB301+TcChi1 (A. tumefaciens chủng
LBA4404) Môi trường
nuôi cấy
LB + kanamycin (50 µg/ml) (đối với E. coli chủng DH5α)
LB + rifamycin (50 µg/ml) + kanamycin (50 µg/ml) +
chloromycin (25 µg/ml) (đối với A. tumefaciens chủng
EHA105)
LB + rifamycin (50 µg/ml) + carbenicilin (50 µg/ml) +
kanamycin (50 µg/ml) (đối với A. tumefaciens chủng
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT MANG GEN MÃ
HÓA CHITINASE (TcChi1-U) SỬ DỤNG HỆ VECTOR pPIPRA
Hệ vector biểu hiện thực vật pPIPRA do phía đối tác Hoa Kỳ chuyển giao mang một số đặc tính quan trọng: (1) Mang gen kháng kanamycin dùng cho chọn lọc vi khuẩn và chọn lọc thực vật; (2) Mang FMV34S promoter và E9 terminator. Đây là các đoạn khởi động và kết thúc có giá trị. Trong đó, FMV34S là promoter cơ định có khả năng điều khiển biểu hiện gen rất mạnh. Như đã trình bày, promoter này được thành viên của PIPRA, Trường Đại học California bảo hộ dưới dạng sáng chế [33][34]. Với mục đích tạo nguồn nguyên liệu cho chuyển gen mã hóa chitinase vào cây, ngoài cấu trúc
pCB301+TcChi1, chúng tôi đã tiến hành thiết kế và tạo vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase TcChi1-U nằm dưới sự điều khiển của
FMV34S promoter và E9 terminator.
3.2.1. Sơ đồ thí nghiệm
Sau khi nghiên cứu bản đồ của một số vector biểu hiện hiện có, chúng tôi đã xây dựng chiến lược thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen
mã hóa TcChi1-U trên cơ sở pPIPRA558, pPIPRA522 và pJET + TcChi1-
W/1. Các bước tiến hành được thực hiện như sau (Hình 3.12):
(1) Nhân đoạn gen TcChi1-U từ vector tạo dòng tái tổ hợp