a. Chuẩn bị tế bào khả biến
Bước 1 Chủng vi khuẩn được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua
đêm ở 370C.
Bước 2 Cấy một khuẩn lạc đơn vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc qua đêm
ở 370C, 200 v/p.
Bước 3 Chuyển 0,5 ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng, lắc
tiếp khoảng 3 giờ đến khi OD600nm đạt 0.6 - 0.8 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá.
Bước 4 Ly tâm 6.000 v/p, 40C, 10 phút, thu cặn tế bào
Bước 5 Hoà tan cặn nhẹ nhàng trong 20 - 30 ml 0,1 M CaCl2, giữ ống tế
bào trong đá 20 phút, ly tâm ở 4.200 v/p, 40C trong 10 phút, thu cặn.
Bước 6 Lặp lại bước 1 lần bước 4 và hòa cặn nhẹ nhàng trong 0,7 - 1,5 ml
0,1 M CaCl2.
Bước 7 Chia vào mỗi ống eppendorf 50 l dịch tế bào, bổ sung 50 l glycerol 60%, làm đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -700C.
Bước 8 Cấy trải mẫu trên môi trường LB có/ không có kháng sinh để kiểm tra
[32].
b. Biến nạp DNA vào tế bào khả biến E. coli bằng phương
pháp sốc nhiệt
Nguyên tắc: khi bị chuyển từ nhiệt độ thấp lên cao đột ngột, màng tế bào vi khuẩn sẽ bị thay đổi, trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các “lỗ” khiến cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, nhiệt độ lại xuống thấp đột ngột, các “lỗ” sẽ khép lại. Các tế bào được phục hồi trên môi trường nuôi cấy và các tế bào đã được biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc.
Quy trình: Hòa 6 μl sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá 30 phút sau khi lấy ra từ tủ -700C, giữ trong đá 15 phút. Sốc nhiệt ở 420C trong 40 - 50 giây sau đó chuyển ngay xuống
00C và giữ trong vòng 5 phút cho tế bào ổn định. Bổ sung 300 µl môi trường
LB, nuôi lắc ở 370C trong 1 giờ. Sau đó vi khuẩn được cấy trải trên đĩa môi
trường LB chọn lọc có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi qua đêm ở 370C
[32].