thơm, P6 trước khi trích ly.
CT thí nghiệm CT1 CT2 CT3
Hàm lượng ɤ- oryzanol có trong cám gạo(%)
Khang dân Bắc thơm P6
Chúng tôi lựa chọn nguyên liệu cám gạo Khang dân, Bắc thơm, P6 lấy từ các cơ sở xay sát gạo ởĐan Phượng Hà Nội. Cám gạo được đóng gói vào túi và bảo quản ở nhiệt độ 50C. Do cám gạo ở trạng thái xốp, tế bào phá vỡ, có hệ enzym lipase nội tại, cùng sự xâm nhập của môi trường, nên phản ứng thủy phân và oxi hóa của dầu trong cám phát triển nhanh. Cám gạo rất dễ bị ôi hỏng, chua khét… Nên ta cần xử lý cám gạo nguyên liệu trước khi đưa vào quá trình trích ly ɤ- oryzanol để quá trình trích ly xảy ra thuận lợi hơn mà không gây ra các ảnh hưởng xấu đến hiệu suất thu hồi ɤ- oryzanol .
Cám gạo được xử lý đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu
+ Khối lượng mẫu: 100g, dung môi trích ly: Cồn 960, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: 1/5, nhiệt độ trích ly: 650C, thời gian trích ly: 4 giờ
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD ở bước sóng 320nm để xác định ɤ- oryzanol . Thí nghiệm này xác định được mẫu nguyên liệu phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần
b, Xác định phương pháp xử lý cám gạo cho trích ly ɤ- oryzanol từ cám gạo
Để xác định thời gian sấy nguyên liệu phù hợp cho việc tách chiết hoạt chất, chúng tôi khảo sát các thời gian sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
CT thí nghiệm CT4 CT5 CT6
Thời gian sấy cám gạo nguyên liệu ( giờ)
1 2 4
- Tiến hành cân 100g cám gạo, cho vào cốc thủy tinh đem sấy trong tủ sấy tựđộng khống chế nhiệt độ, ở 1000C – 1050C trong thời gian 10 phút.
- Trong quá trình sấy tiến hành đảo trộn cám để nhiệt độ tiếp xúc cám đều hơn. - Sau đó sấy tiếp, hạ nhiệt độ của tủ sấy xuống 600C khoảng thời gian 3 giờ, đảo trộn đều tay cho tới khi độ ẩm của cám đạt khoảng 5 %. Ta thu được cám gạo nguyên liệu để thực hiên các thí nghiệm tiếp theo.
Cám gạo được đem trích ly ở cùng điều kiện. Ban đầu chúng tôi cố định các điều kiện để dễ dàng cho nghiên cứu:
+ Khối lượng mẫu: 100g, dung môi trích ly: Ethanol 960, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: 1/4, nhiệt độ trích ly: 650C, thời gian trích ly: 4 giờ
Dịch thô thu được đem lọc qua giấy lọc. Sau đó đo OD ở bước sóng 320nm để xác định ɤ- oryzanol . Thí nghiệm này xác định được mẫu nguyên liệu phù hợp nhất và dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần.
2.4.1.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm ɤ- oryzanol từ
cám gạo để sản xuất thực phẩm chức năng
a, Ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu suất trích ly ɤ- oryzanol từ cám gạo
Trong thí nghiệm chúng tôi khảo sát 3 loại dung môi:
CT thí nghiệm CT7 CT8 CT9
Loại dung môi n- Hexan Isopropyl alcohol Ethanol
+ Tiến hành cân: 100g cám gạo có độ ẩm thích hợp là 5%, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: 1/4, nhiệt độ trích ly: 650C, thời gian trích ly: 4 giờ trích ly 3 mẫu song song bằng bộ trích ly Soxhlet.
- Dịch trích ly được xử lý thu hồi dung môi đến trong lượng không đổi. Lượng hoạt chất sinh học thô đem tinh chế để thu được hoạt chất tinh. Dựa vào hiệu suất trích ly xác định loại dung môi nào cho hiệu suất trích ly cao nhất
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
b. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu suất trích ly cám gạo
Để xác định nồng độ dung môi phù hợp cho việc tách chiết hoạt chất, chúng tôi khảo sát các nồng độ sau:
CT thí nghiệm CT10 CT11 CT12
Nồng độ ethanol (độ) 65 75 96
Sau khi làm thí nghiệm xác định loại dung môi ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly lựa chọn được loại dung môi thích hợp. Tiến hành thí nghiệm dung môi đã chọn trên các nồng độ dung môi là 650, 750, 960 ở cùng điều kiện công nghệ để xác định nồng độ dung môi phù hợp cho việc tách chiết hoạt chất.
+ Tiến hành cân: 100g cám gạo có độ ẩm thích hợp là 5%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/4, nhiệt độ trích ly: 650C, thời gian trích ly: 4 giờ trích ly 3 mẫu song song bằng bộ trích ly Soxhlet.
- Dịch trích ly được xử lý thu hồi dung môi đến trọng lượng không đổi. Lượng hoạt chất sinh học thô đem tinh chế để thu được hoạt chất tinh. Dựa vào hiệu suất trích ly xác định nồng dung môi là bao nhiêu thì cho hiệu suất trích ly cao nhất
c,Ảnh hưởng của nhiệt độđến hiệu suất trích ly ɤ- oryzanol từ cám gạo
Để xác định được nhiệt độ trích ly tối ưu cho quá trình tách chiết gamma oryznol, tiến hành thí nghiệm ở các mức nhiệt độ là:
CT thí nghiệm CT13 CT14 CT15 CT16 CT17
Nhiệt độ (°C) 45 55 65 70 90
Để xác định nhiệt độ trích ly ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly ta tiến hành thí nghiệm ở các mức nhiệt độ là 450C, 550C, 650C, 700C, 900C.
+ Tiến hành cân: 100g cám gạo có độẩm thích hợp là 5%, dung môi trích ly: Ethanol 960, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi:1/4, thời gian trích ly: 4 giờ trích ly 5 mẫu song song bằng bộ trích ly Soxhlet.
- Dịch trích ly được xử lý thu hồi dung môi đến trong lượng không đổi. Lượng hoạt chất sinh học thô đem tinh chế để thu được hoạt chất tinh. Dựa vào hiệu suất trích ly xác định nhiệt độ trích ly là bao nhiêu thì cho hiệu suất trích ly
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
cao nhất.
d, Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly ɤ- oryzanol từ cám gạo
Tiến hành thí nghiệm với các ngưỡng thời gian cho mỗi lần trích ly là:
CT thí nghiệm CT18 CT19 CT20 CT21 CT22
Thời gian (h) 2 3 4 5 6
Tiến hành thí nghiệm với các ngưỡng thời gian cho mỗi lần trích ly là: 2h, 3h, 4h, 5h, 6h để xác định thời gian trích ly phù hợp cho hiệu suất trích ly cao nhất.
Tiến hành cân: 100g cám gạo có độ ẩm thích hợp là 5%, dung môi trích ly: Ethanol 960, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi:1/4, nhiệt độ trích ly: 650C, trích ly 5 mẫu song song bằng bộ trích ly Soxhlet.
- Dịch trích ly được xử lý thu hồi dung môi đến trong lượng không đổi. Lượng hoạt chất sinh học thô đem tinh chế để thu được hoạt chất tinh. Dựa vào hiệu suất trích ly xác định thời gian trích ly là bao nhiêu thì cho hiệu suất trích ly cao nhất.
e, Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất triết ly ɤ- oryzanol từ
cám gạo
Tiến hành thí nghiệm với các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (w/v) với các công thức dưới đây để xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp nhất cho việc trích ly hoạt chất.
CT thí nghiệm CT23 CT24 CT25 CT26 CT27
Tỷ lệ cám gạo/ethanol 960 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5
- Thí nghiệm tiến hành với các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là:1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 để xác định tỷ lệ dung môi/nguyên liệu phù hợp nhất cho việc tách chiết hoạt chất.
+ Tiến hành cân: 100g cám gạo có độẩm thích hợp là 5%, dung môi trích ly: Ethanol 960, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi:1/4, nhiệt độ trích ly: 650C, thời gian trích ly: 4 giờ trích ly 5 mẫu song song bằng bộ trích ly Soxhlet.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42
Dịch trích ly được xử lý thu hồi dung môi đến trong lượng không đổi. Lượng hoạt chất sinh học thô đem tinh chế để thu được hoạt chất tinh. Dựa vào hiệu suất trích ly xác định nhiệt độ trích ly là bao nhiêu thì cho hiệu suất trích ly cao nhất
f, Ảnh hưởng của các yếu tố khác đến quá trình tinh chế tạo chế phẩm ɤ-
oryzanol từ cám gạo
- Xác định lượng NaOH cho xà phòng hóa dịch trích ly cám gạo:
Để xà phòng hóa hoàn toàn lipit của dịch trích ly cám gạo chúng tôi sử dụng NaOH để xà phòng hóa ở nhiệt độ 900C/6 giờ, bằng phương pháp định lượng NaOH dư trong dịch xà phòng hóa, chúng tôi xác định được hàm lượng NaOH cho xà phòng hóa hoàn toàn lipit có trong dịch trích ly của cám gạo là 1,7% trong dịch trích ly cám gạo (dầu cám gạo thô).
- Xác định thời gian xà phòng hóa dịch trích ly cám gạo
+ Dịch trích ly cám gạo (đã được loại dung môi) đem xà phòng hóa bằng NaOH, tỷ lệ trọng lượng NaOH/dịch trích ly cám gạo = 1,7/100, ở 900C tiến hành thí nghiệm với các ngưỡng thời gian cho mỗi lần xà phòng hóa là 30, 40, 50, 60,70, 80 phút. - Xác định thời gian sấy hỗn hợp xà phòng. Dịch trích ly cám gạo đã xà phòng hóa đem sấy đối lưu hỗn hợp xà phòng với các ngưỡng 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140p hút/1150C cho độ ẩm của xà phòng đạt 5%. CT thí nghiệm CT28 CT29 CT30 CT31 CT32 CT33 CT34 Thời gian sấy (Phút) 80 90 100 110 120 130 140
- Xác định thời gian trích ly ɤ- oryzanol bằng ethanol từ xà phòng:
Xà phòng sau khi sấy ở 1150C/2 giờ được trích ly bằng cồn ethanol 960 theo tỷ lệ 3/1, trích ly ở 650C trong ngưỡng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 giờ.
CT thí nghiệm CT35 CT36 CT37 CT38 CT39
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
+ Dịch trích ly cám gạo (đã được loại dung môi ) đem xà phòng hóa bằng NaOH, tỷ lệ NaOH/ dịch trích ly cám gạo = 1,7/100, ở 900C
Xà phòng sau khi sấy ở 1150C/2 giờđược trích ly bằng ethanol 960 theo tỷ lệ 1/4, trích ly ở 650C trong ngưỡng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 giờ
- Tách sáp và thu ɤ- oryzanol từ dịch trích ly
Để tách sáp ra khỏi ɤ- oryzanol sau khi trích ly thường dùng phương pháp hạ thấp nhiệt độ của dịch dung môi hòa tan sáp và ɤ- oryzanol để kết tủa sáp mà ɤ- oryzanol vẫn tan trong dung môi. Chúng tôi sử dụng phương pháp tách xáp của
Xu và Godber. Dịch trích ly từ xà phòng được cho bay hơi dung môi để thu chất không xà phòng hóa, chất không xà phòng hóa tiếp tục hòa trở lại với dung môi ethyl acetate và methanol (tỷ lệ 1:1) hạ thấp nhiệt độ xuống 120C sau 24 giờ, lọc tách sáp, dịch lọc thu được dịch lọc thu được cô bay hơi dung môi thu được ɤ- oryzanol có độ tinh kiết đạt 61%.
- Ảnh hưởng nhiệt độđến hiệu suất thu ɤ- oryzanol kết tinh trong acetone
Thu hồi ɤ- oryzanol kết tinh bằng cách hòa tan 1 gam ɤ- oryzanol trong 100g aceton, để lạnh dung dịch này ở nhiệt độ xác định sau 12 giờ được lọc thu hồi ɤ- oryzanol, đem cân để xác định hiệu xuất thu hồi ɤ- oryzanol kết tinh.
CT thí nghiệm CT40 CT41 CT42 CT43 CT44
Nhiệt độ (0C) -10 -5 0 5 10
- Ảnh hưởng của thời gian làm lạnh kết tinh ɤ- oryzanol đến hiệu xuất thu
ɤ- oryzanol tinh thể
CT thí nghiệm CT45 CT46 CT47 CT48 CT49 CT50 Thời gian làm kết tinh
ɤ- oryzanol (giờ) 3 6 9 12 15 18
Tiến hành: Hòa tan 1g ɤ- oryzanol/100g acetone, kết tinh ɤ- oryzanol ở 00C. Xác định hiệu suất thu ɤ- oryzanol kết tinh ở các mốc thời gian làm lạnh cho kết tinh ɤ- oryzanol khác nhau: 3, 6, 9, 12, 15 và 18 giờ