Đánh giá KNKH bằng lai luân phiên được đề xuất bởi G.F.Sprague và Tatun (1942)[70]. Năm 1947, East đã sử dụng hệ thống lai luân phiên để xác định KNKH của các kiểu gen trong thí nghiệm chọn giống ngô lai. Sau East, tác giả B.I.Hayman (1954)[48], đã phát triển thêm lý thuyết lai luân phiên.
Trong phân tích lai luân phiên có hai phương pháp là phương pháp Hayman và phương pháp Griffing.
- Phương pháp Hayman: Phương pháp này giúp phân tích các tham số di truyền của vật liệu bố mẹ cũng như ước đoán giá trị các tham số này ở
43
các THL (Hayman, 1954)[48].Tuy nhiên, việc xác định các tham số di truyền nêu trên khó đạt được kết quả chính xác vì bố mẹ không hoàn toàn thoả mãn 6 điều kiện của Hayman nêu ra.
- Phương pháp Griffing: Phương pháp phân tích griffing cho biết thành phần biến động KNKH chung, KNKH riêng được quy đổi sang thành phần biến động do hiệu quả cộng tính, hiệu quả trội và siêu trội của các gen (B.Griffing, 1956)[67], Griffing đã đưa ra 4 sơ đồ lai luân phiên và các phân tích thống kê tương ứng để đánh giá KNKH của các vật liệu.
+ Sơ đồ 1: Gồm các THL thuận, nghịch và dòng bố mẹ. Số THL là n2. + Sơ đồ 2: Gồm các THL thuận và dòng bố mẹ. Số THL là n(n+1)/2 + Sơ đồ 3: Chỉ có các THL thuận nghịch. Số THL là n(n-1)
44
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu để chọn tạo dòng thuần
Gồm 25 giống ngô các loại chia làm 3 nhóm gồm: 05 giống ngô địa phương; 05 giống ngô thụ phấn tự do cải tiến và quần thể; 15 giống ngô lai nhập nội.
Bảng 2.1. Nguồn vật liệu chọn tạo dòng thuần
TT Tên giống Nguồn gốc TT Tên giống Nguồn gốc Nhóm 1: Các giống địa phương 12 NK66 Syngenta
1 Tẻ vàng Đồng Văn - Hà Giang 13 B9698 Bioseed
2 Tẻ vàng Na Hối - Lào Cai 14 B9034 Bioseed
3 Tẻ Vàng Mai Sơn - Sơn La 15 P.3011 Pioneer
4 Tẻ Vàng Phong Thổ - Lai Châu 16 NK4300 Syngenta 5 Tẻ Vàng Tủa Chùa - Điện Biên 17 CP 989 CP Group
Nhóm 2: Các giống TPTD cải tiến và quần thể 18 CP3Q CP Group
6 Q2 Viện NC Ngô 19 CP A88 CP Group
7 Pop 24 CIMMYT 20 DK414 Monsanto
8 TSB 1 ( SW 1) Thái Lan 21 B06 Bioseed
9 SW5 Thái Lan 22 DK171 Monsanto
10 NS1 Thái Lan 23 CP333 CP Group
Nhóm 3: Giống lai nhập nội 24 30Y87 Pioneer
45
2.1.2. Các dòng thuần được tạo ra từ các nguồn vật liệu khác nhau
Gồm 25 dòng mới được tạo ra từ các vật liệu khác nhau có đời tự phối S6, trong đó có 03 dòng được tạo từ giống địa phương, 04 dòng được tạo từ giống thụ phấn tự do cải tiến và quần thể, 18 dòng được tạo ra từ giống lai thương mại và 02 dòng đối chứng là DF2 (Mẹ LVN 10) và IL 9 (Bố LVN 8960) (bảng 2.2):
Bảng 2.2. Các dòng được tạo ra từ nguồn vật liệu khác nhau
TT Tên dòng Nguồn gốc TT Tên giống Nguồn gốc Nhóm 1: Các giống địa phương 13 D - NK 54.1 NK 54
1 D - TVĐV Tẻ vàng, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đồng Văn - Hà Giang 14 D - NK 54.2 NK 54
2 D - TVNH Tẻ vàng,
Na Hối - Lào Cai 15 D - B9034.1 B9034 3 D - TVMS Tẻ vàng,
Mai Sơn - Sơn La 16 D - B9034.2 B9034
Nhóm 2: Các giống TPTD cải tiến và
quần thể 17 D - NK 4300 NK 4300
4 D - Q2.1 Q2 18 D - DK414 DK414
5 D - Pop24.1 Pop 24 19 D - CP3Q CP3Q
6 D - Pop24.2 Pop 24 20 D - 30Y87.1 30Y87
7 D - TSB 1 TSB 1 21 D - 30Y87.2 30Y87
Nhóm 3: Giống lai nhập nội 22 D - CP 989 CP 989
8 D - B06 B06 23 D - CP333 CP333
9 D - CP A88 CP A88 24 D - DK 171.1 DK 171
10 D - DK5252 DK 5252 25 D - DK 171.2 DK 171
11 D - NK 66 NK 66 26 DF2 (Đ/c 1) Mẹ LVN 10
12 D - B 9698 B 9698 27 IL9 (Đ/c 2) Bố VN 8960
2.1.3. Các dòng triển vọng được lựa chọn đánh giá tại Tây Bắc
Gồm 15 dòng triển vọng, được mã hóa theo ký hiệu từ D1 đến D15 và 02 dòng đối chứng là DF2 (Mẹ LVN 10) và IL 9 (Bố LVN 8960).
46
Bảng 2.3. Các dòng triển vọng được chọn để tiếp tục đánh giá tại Tây Bắc
TT Mã hóa Dòng TT Mã hóa Dòng 1 D1 D - 30Y87.2 10 D10 D – B9034.2 2 D2 D - DK 5252 11 D11 D - NK 4300 3 D3 D – CP A88 12 D12 D - CP333 4 D4 D - DK 171.1 13 D13 D - B 9698 5 D5 D – CP3Q 14 D14 D - Pop24.1 6 D6 D - B06 15 D15 D - NK 66 7 D7 D - NK 54.1 16 DF 2 (Đ/c 1) Mẹ LVN 10 8 D8 D - CP989 17 IL9 (Đ/c 2) Bố LVN 8960 9 D9 D – DK 414
2.1.4. Các tổ hợp lai đỉnh giữa các dòng triển vọng và cây thử
- 30 tổ hợp lai giữa 15 dòng (D1 đến D 15) và cây thử (DF2 và IL9); - 01 giống đối chứng là C919
2.1.5. Các tổ hợp lai luân phiên (Diallel)
- 28 tổ hợp lai giữa các dòng ưu tú gồm: D4, D8, D10, D11, D12, D13, D14 và D15;
- 02 giống đối chứng là C919 và NK 6326.
2.1.6. Các tổ hợp lai triển vọng
- 12 tổ hợp lai triển vọng, trong đó có 04 tổ hợp lai đỉnh (D9 x IL 9, D12 x IL 9, D13 x IL 9 và D14 x IL 9) và 8 tổ hợp lai luân giao (D4 x D8, D4 x D14, D8 x D14, D10 x D11, D12 x D13 - LVN 255, D12 x D 14, D13 x D 14 và D14 x D 15 - LVN 26).
- 03 đối chứng là LVN 99, DK 9901 và NK 6326.
2.1.7. Các mồi sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm phân tích đa dạng di truyền các dòng ngô thuần sử dụng 17 mồi SSR có kiểu lặp lại đa dạng và nằm trên các NST khác nhau để phân tích (bảng 2.4).
47
Bảng 2.4. Danh sách 17 mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu(*)
STT Tên mồi Vị trí trên NST Kiểu lặp lại Kích thPCR (bp) ước sản phẩm
1 phi029 3.04 AG/AGCG*** 148-162 2 phi032 9.04 AAAG 233-241 3 phi053 3.05 ATAC 169-195 4 phi065 9.03 CACTT 131-151 5 phi072 4.00 AAAC 143-167 6 phi079 4.05 AGATG 180-195 7 phi083 2.04 AGCT 125-137 8 phi093 4.08 AGCT 274-294 9 phi101049 2.09 AGAT 230-274 10 phi109188 5.00 AAAG 148-174 11 phi109275 1.00 AGCT 117-143 12 phi233376 8.03 CCG 142-154 13 phi299852 6.08 AGC 111-147 14 phi308707 1.10 AGC 116-134 15 phi374118 3.02 ACC 217-238 16 phi96342 10.02 ATCC 234-250 17 umc1545 7.00 (AAGA) 4 70-86
(*)Nguồn: Maize genetics and genomics database(http://alpha.maizegdb.org)
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm nông học của các vật liệu phục vụ chương trình chọn tạo giống ngô lai cho vùng Tây Bắc.
- Nội dung 2: Đánh giá đặc điểm nông sinh học của tập đoàn dòng được tạo ra từ các nguồn vật liệu.
- Nội dung 3: Đánh giá đặc điểm nông sinh học và tính đa hình di truyền của các dòng triển vọng.
- Nội dung 4: Đánh giá khả năng kết hợp của các dòng triển vọng thông qua (lai đỉnh, lai luân phiên).
- Nội dung 5: Thí nghiệm khảo sát, đánh giá các THL triển vọng tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc.
48
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR [59]. Phương pháp tách chiết ADN tổng số: Phương pháp tách chiết ADN tổng số:
Mỗi dòng lấy 10 - 15 cây đại diện, mỗi cây lấy một lá ở giai đoạn 15 ngày tuổi; ADN tổng số được tách chiết từ các lá non của cây ngô 15 ngày tuổi theo phương pháp sử dụng CTAB của Saghai-Maroof và cs (1984).
Các mẫu ADN tổng số được kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng = 260nm và = 280nm. Tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8-2,0 là phù hợp. Ngoài ra, kết hợp kiểm tra chất lượng và số lượng ADN tổng số được tách chiết bằng cách điện di trên gel agarose 1%.
Phương pháp PCR, chạy điện di và nhuộm bạc:
Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần với hàm lượng cụ thể được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần của một phản ứng PCR
STT Thành phần Nồng độ phản ứng Thể tích (µl)
1 Nước cất hai lần khử ion - 5,60
2 Đệm PCR 10 x 1 x 1,00
3 MgCl2 25 mM 2,0 mM 0,80
4 dNTPs 10 mM 0,25 mM 1,00
5 Taq ADN polymerase 5U/µl 0,5 U 0,10
6 Mồi xuôi 5 µM 0,25 µM 0,25
7 Mồi ngược 5 µM 0,25 µM 0,25
8 ADN 10 ng/µl 10 ng 1,00
Tổng thể tích của một phản ứng 10,00 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100TM theo chu trình được trình bày ở bảng 2.6.
49
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
STT Bước thực hiện Nhiệt độ (oC), thời gian
1 Biến tính ban đầu 94oC trong 2 phút
2 Biến tính 94oC trong 30 giây
3 Gắn mồi 56oC trong 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72oC trong 1 phút
5 Lặp lại chu kỳ Trở về bước 2; 29 lần 6 Kéo dài chuỗi cuối cùng 72oC trong 5 phút
7 Bảo quản 4oC, ∞
Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 4,5% với công suất 60W, nhiệt độ trên gel khoảng 50 - 550C trong thời gian 55 - 60 phút. Sau khi sản phẩm điện di sẽ được biểu hiện bằng phương pháp nhuộm bạc và đọc số liệu.
2.3.2. Bố trí thí nghiệm đồng ruộng
Thí nghiệm so sánh, đánh giá các dòng và THL được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh, 3 lần nhắc lại. Mỗi dòng, giống được gieo 4 hàng (dài 4 m, rộng 0,6 m).
2.3.3. Chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu theo dõi được tiến hành theo phương pháp đánh giá và thu thập số liệu của CIMMYT và Viện Nghiên cứu Ngô.
Thời gian sinh trưởng:
- Số ngày từ gieo đến trỗ cờ, tung phấn, phun râu (khi có 70 % số cây trên ruộng trỗ cờ, tung phấn, phun râu).
- Thời gian từ gieo đến chín sinh lý (khi chân hạt có điểm đen ở 70% số cây).
Các chỉ tiêu hình thái cây, bông cờ:
- Chiều cao cây được đo sau trỗ 15 ngày trên 10 cây liên tiếp ở mỗi ô (trừ cây đầu hàng), tính từ mặt đất đến điểm đầu tiên phân nhánh cờ.
50
- Số lá xanh vào thời điểm vào thời điểm chín sinh lý, theo CIMMYT, được xác định theo thang 10 điểm (1- 10) tương ứng với phần trăm (%) lá bị chết là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%.
- Chiều dài bông cờ: Tính từ cổ bông cờ đến điểm cao nhất của trục chính. - Số nhánh cờ: Được đếm các nhánh cờ cấp 1.
Khả năng chống chịu:
- Sâu bệnh: Xác định theo thang điểm từ 1 - 5 (Điểm 1 nhiễm nhẹ, điểm 5 nặng).
- Chống đổ: Đổ thân (%) được tính khi cây gãy ngang dưới bắp hữu hiệu; Đổ rễ (%) được tính khi cây đổ nghiêng 1 góc > 300 so với phương thẳng đứng.
Các yếu tố cấu thành năng suất:
Số hàng hạt/bắp: 1 hàng hạt được tính khi có 50% số hạt so với hàng dài nhất.
Số hạt trên hàng: được đếm theo hàng hạt có chiều dài trung bình trên bắp. Chiều dài bắp (cm): được đo từ phần bắp có hàng hạt dài trung bình, đo từ cuối bắp đến đỉnh đầu của hàng hạt.
Đường kính bắp (cm): đo ở phần rộng nhất của bắp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khối lượng 1000 hạt (g): ở độ ẩm 14 %, cân 2 mẫu, mỗi mẫu 500 hạt, chênh lệch giữa 2 lần cân nhỏ hơn 5 %, đo độ ẩm hạt rồi quy về khối lượng ở ẩm độ 14 %.
Năng suất thực thu (NSTT) ở ẩm độ 14 % được tính theo công thức:
Sô x 14) - (100 100 x ) A - (100 x KE x EWP (ta/ha) NSTT
Trong đó: EWP là khối lượng bắp thu hoạch/ô (kg); KE là tỷ lệ hạt/bắp; A° là ẩm độ hạt khi thu hoạch; Sô là diện tích ô thí nghiệm (m2).
51
+ ƯTL trung bình (Hmp): giá trị một tính trạng nào đó của con lai (F1) so với giá trị trung bình của bố mẹ (MP)
F1 - MP
Hmp (%) = x 100 MP
+ ƯTL thực (Hbp): giá trị một tính trạng nào đó của con lai (F1) so với giá trị bố mẹ tốt nhất (BP)
F1 - BP
Hbp (%) = x 100 BP
+ ƯTL chuẩn (Hs): giá trị một tính trạng nào đó của con lai (F1) so với giá trị giống thương mại đại trà (S)
F1 - S
Hs (%)= x 100 S
2.3.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
- Số liệu được thu thập và xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mềm quản lý và nghiên cứu thống kê MSTATC (Management ADN Statistical Research Tool);
- Số liệu được thống kê và xử lý theo hướng dẫn của AMBIONET - CIMMYT (2004). Dựa vào thang chuẩn phiX174/HinfI, số liệu được đọc theo quy ước: các alen xuất hiện băng ADN (1), không xuất hiện băng (0) và khuyết số liệu (9). Kết quả được phân tích bằng chương trình NTSYS pc 2.1.
Hệ số PIC (Polymorphic Information Content - Chỉ số thông tin đa hình) (Anderson và cs, 1993)
PIC = 1- ∑P2i ;
Trong đó: Pi là tần số xuất hiện của alen thứ i
Tỷ lệ khuyết số liệu (M%) được tính cho từng dòng và từng mồi. M % dòng = (Số mồi khuyết số liệu/tổng số mồi) x 100.
52
M% mồi = (Số dòng khuyết số liệu/tổng số dòng) x 100 Khoảng cách di truyền (GD):
GD = 1 - GS
Trong đó: GD là khoảng cách di truyền; GS là độ tương đồng di truyền được tính theo hệ số Jaccard (Jaccard, 1908).
Phân nhóm bằng phương pháp UPGMA (Unweighted Pair - Group Method with Arithmetical Averages).
2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.4.1. Địa điểm nghiên cứu 2.4.1. Địa điểm nghiên cứu
- Đánh giá vật liệu, chọn tạo và đánh giá đa dạng di truyền của các dòng triển vọng tại Viện Nghiên cứu Ngô (Đan Phượng - Hà Nội và Lạc Thủy - Hòa Bình).
- Các thí nghiệm đánh giá các dòng triển vọng và các THL đỉnh lai luân phiên tại Chiềng Sung, Mai Sơn, Sơn La.
- Thí nghiệm đánh giá các THL triển vọng tại các tỉnh thuộc vùngTây Bắc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2. Thời gian nghiên cứu
Các nội dung chính của đề tài thực hiện từ năm 2005 đến năm 2013, cụ thể:
- Năm 2005 đến 2008: Đánh giá vật liệu và tạo dòng thuần;
- Năm 2009 đến 2010: Đánh giá đặc điểm nông sinh học và phân tích đa hình di truyền của các dòng tham gia nghiên cứu trong điều kiện khí hậu của Tây Bắc;
- Từ năm 2009 – 2014: Lai tạo, khảo sát và đánh giá các THL đỉnh và lai luân phiên, khảo nghiệm giống, xử lý số liệu, viết và hoàn chỉnh luận án.
53
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Một số đặc tính nông sinh học chính của các nguồn vật liệu tạo dòng
Để xác định một số đặc điểm chính của các vật liệu trước khi rút dòng chúng tôi tiến hành đánh giá các vật liệu thông qua các đặc điểm nông sinh học chính của chúng. Số liệu được trình bày trong các bảng 3.1, 3.2, 3.3 và 3.4 cho thấy:
3.1.1. Đặc điểm nông sinh học của nguồn vật liệu là giống địa phương
Các giống địa phương có đặc điểm chính là cao cây, thời gian sinh trưởng ngắn, dễ bị đổ gãy và cho năng suất thấp. Ưu điểm của các giống địa phương là có khả năng chống chịu tốt với sâu đục thân, sâu đục bắp, các loại bệnh hại và có mầu hạt đẹp. Thời gian sinh trưởng của các giống ngắn, dao động từ 105 - 115 ngày trong vụ Xuân, 98 - 100 ngày trong vụ Thu Đông; Chiều cao cây của các giống vụ Xuân các giống đạt 221,1- 237,6 cm, vụ Thu Đông 213,41 - 229,28 cm; nhiễm nhẹ sâu đục thân, đục bắp, bệnh đốm lá, bị đổ gãy khá nặng, nhất là khi gặp điều kiện mưa to, gió lớn.
Trung bình chiều dài bắp của các giống trong vụ Xuân là 13,0- 15,8 cm, vụ Đông là 11,9 - 15,5 cm, kết hạt rất tốt, bắp không đồng đều, đường kính bắp không lớn, số hàng hạt/bắp 12,2 - 14,2 hàng, tỷ lệ hạt/bắp trung bình