Trong 10 năm (1982 – 1992), Chương trình tạo giống ngô lai - Kasetsart University (KU), Thailand đã sử dụng các giống thụ phấn tự do như: SW1, SW3 và một số giống lai như Pacific 9, Pacific 11 làm nguyên liệu rút dòng và đã tạo ra 44 dòng mang tên Ki1 đến Ki44 (Chutkaew, 1993, 1993, 1996)[32]. Tuy nhiên, thành tích tạo nên giống lai của các dòng Ki (Dòng tự phối của KU) còn hạn chế. Chỉ có một số ít dòng như: Ki21, rút từ Pacific9, đã tham gia vào một số giống lai được sử dụng trong sản xuất và 2 dòng Ki32 và Ki31 tham gia tạo giống lai có dầu cao và kháng bệnh bạch tạng.
1.6.4. Nghiên cứu nguồn vật liệu tạo dòng ở Việt Nam
Từ những năm 70 và nhất là những năm đầu thập kỷ 90 các nhà tạo giống ngô lai Việt Nam đã bắt đầu tạo dòng từ những giống tổng hợp, giống hỗn hợp cải thiện, từ những cặp lai tự tạo và những giống lai nhập nội. Cụ thể chúng ta đã thực hiện rút dòng từ các giống tổng hợp, hỗn hợp cải thiện như Xiêm Sông Bôi, Lùn vàng (Brazil), GG5 (Lai 3 Ấn độ), Bigei (Nhật Bản), Q2, TSB1, 2649 và các quần thể, các cặp lai tự tạo khác.
Các nhà tạo giống cũng biết tận dụng khai thác các quần thể nhập nội từ CIMMYT, đặc biệt từ những quần thể thích ứng với điều kiện Việt Nam và nằm trong các cặp ưu thế lai đã được khẳng định như: QT24, QT36, QT28, SW1, QT31, Pool26,… Bên cạnh đó, chúng ta cũng đã tập trung vào việc rút dòng từ các giống lai đơn thương mại như: CP 888, CP 999, P3012, Cargill- 777, Pacific- 351, Pacific-9901, CGX-04466.
Nhìn chung công tác tạo dòng từ các giống địa phương, các quần thể còn rất hạn chế do phần lớn các giống địa phương và quần thể có năng suất thấp, suy giảm do tự phối rất mạnh, khả năng kết hợp thấp. Tuy nhiên, trong tập đoàn vật liệu địa phương cũng biểu hiện nhiều đặc tính mong muốn như thời gian sinh trưởng ngắn, chất lượng hạt cao, có màu sắc đẹp,… Đây là
30
những đặc điểm quý mà các nhà cải tạo có thể sử dụng, thông qua việc thu nạp chúng vào các quần thể hoặc tổ hợp lai định hướng để tạo dòng.
Với việc rút dòng từ nguồn vật liệu là giống lai nhập nội và từ các tổ hợp lai đạt kết quả cao hơn. Phần lớn các dòng tốt đã tham gia vào các giống lai được rút từ các nguồn vật liệu này. Từ năm 2000 trở lại đây, hầu hết các công ty hạt giống lớn của thế giới đã có mặt ở Việt Nam, cùng với sự cạnh tranh thì một số lượng lớn các giống lai thương mại tốt nhất của họ đã trở thành nguồn vật liệu tạo dòng thuần đa dạng và quan trọng cho các nhà chọn giống trong nước. Từ đó, hàng loạt các giống lai mới đã được tạo ra, phục vụ cho sản xuất.
1.7. Những đặc tính nông sinh học cần quan tâm trong chọn tạo dòng thuần ngô
Hallauer (1979)[42] và Bauman (1981)[28] đã tổng hợp các điều tra của các nhà tạo giống về các tính trạng mà họ coi trọng hơn trong chọn lọc (bảng 1.6). Năng suất hạt dòng là một trong các tính trạng quan trọng nhất và sẽ được chú ý tương tự hoặc nhiều hơn trong tương lai. Thời gian sinh trưởng, tính chống chịu sâu bệnh và hiệu quả sử dụng đạm phải lưu tâm nhiều hơn. Tầm quan trọng tương đối của các tính trạng và tính hiệu quả của chọn lọc bằng mắt đối với các tính trạng rất khác nhau (bảng 1.6).
Bảng1.6. Tầm quan trọng của các đặc điểm quan tâm trong tạo dòng thuần tương lai cho vùng vành đai ngô
Tình trạng Tầm quan trọng tương đối (%)
Hơn Vẫn thế Kém
Năng suất hạt 35 65 0
Thời gian sinh trưởng 71 26 3
Chống chịu sâu bệnh 81 19 0
Hiệu quả sử dụng đạm 81 19 0
Chịu thuốc trừ sâu 32 62 6
Chịu rét 50 50 0
31
Năng suất hạt và độ cứng của thân được coi là quan trọng nhất, nhưng tính hiệu quả chọn lọc bằng mắt đối với hai tính trạng này rất kém. Ngược lại màu thân cây không được coi là quan trọng nhưng chọn bằng mắt là hiệu quả. Những tính trạng được các nhà chọn giống nhấn mạnh khác nhau và hiệu quả chọn lọc bằng mắt giữa họ cũng rất khác nhau. Đặc biệt hiệu quả chọn lọc bằng mắt với tính trạng sâu bệnh bị ảnh hưởng nhiều bởi những phương tiện lây nhiễm nhân tạo.
Bảng 1.7. Tầm quan trọng và tính hiệu quả của chọn lọc bằng mắt đối với các tính trạng trong tạo dòng thuần ở vùng Vành Đai Ngô
Tính trạng Tầm quan trọng Điểm (1 - 4) tính trạng Hiệu quả chọn lọc bằng mắt Năng suất hạt 1,2 3,2 Độ chắc của thân 1,2 2,5 Độ chắc của rễ 1,4 2,6 Thối thân 1,5 2,3 Phun râu 1,6 1,4 Đốm lá 1,7 1,6 Thối bắp 1,8 2,1 Ngày ra hoa 1,9 1,3 Ngày tung phấn 1,9 1,7 Sức sống cây non 1,9 1,9
Thiệt hại do sâu 2,0 2,7
Chất lượng hạt 2,1 1,9
Chiều cao cây và đóng bắp 2,2 1,5
Nhiễm nấm than nhẹ 2,3 2,2
Dáng cây 2,3 1,8
Lá đứng 3,0 1,6
Màu sắc thân 3,2 1,5
(Bauman, 1981)[28]
32
Ngày nay các nhà chọn giống sử dụng các phương pháp chọn lọc nhiều tính trạng hoặc nhiều giai đoạn thông qua chỉ số chọn lọc. Song các nhà chọn giống khuyên không nên dùng chỉ số chọn lọc hình thức, cũng như không nên dùng phương pháp cải tạo lý tưởng hình thức (Hallauer, 1990)[43].
Phương pháp chọn lọc ở mật độ dày gián tiếp giúp ta chọn được những cá thể chịu được độ ẩm thấp, sử dụng hiệu quả hơn dinh dưỡng, hiệu quả hơn trong phân bổ các chất quang hợp, tính chống chịu sâu bệnh, cải thiện sự đậu hạt, chất lượng thân và rễ. Đặc biệt chọn lọc năng suất ở mật độ cao sẽ làm tăng chiều hướng lá đứng, giảm kích thước cờ.
1.8. Một số phương pháp tạo dòng
Chọn tạo dòng thuần là phần quan trọng nhất của chương trình tạo giống lai. Dòng thuần được sử dụng làm bố mẹ của giống lai giữa 2 hay nhiều bố mẹ. Tuy nhiên, tạo ra được dòng tốt là công việc khó khăn. Thực tế, một số lượng lớn dòng tự phối đã được tạo ra nhưng chỉ một số ít dòng được sử dụng trong các giống lai. Một số phương pháp tạo dòng thuần đã được các nhà khoa học đề xuất và sử dụng như:
1.8.1. Phương pháp tự phối (Standard method)
Người đầu tiên đề xuất phương pháp tự phối để tạo dòng thuần là Shull và đến nay đây vẫn là phương pháp chuẩn được các nhà tạo giống sử dụng. Để tạo vật liệu cho quá trình chọn lọc dễ dàng và chuẩn xác, phải tiến hành đồng huyết hóa mà tự thụ phấn là dạng đồng huyết hóa nhanh nhất. Tự phối gây ra các hiện tượng giảm sức sống, năng suất, phân ly kiểu gen, làm tăng độ thuần. Tự phối sẽ nhanh đạt được độ đồng hợp tử ở nhiều tính trạng và chọn lọc được gen tốt, loại bỏ gen xấu.
Ngô là cây thụ phấn chéo, vì vậy dòng thuần được tạo bằng cách tự thụ cưỡng bức liên tục từng cây một, quá trình tạo dòng được đi cùng với chọn lọc, khi đó chỉ những cây khoẻ, ít nhiễm sâu bệnh hoặc có những đặc tính
33
mong muốn khác được chọn. Vì có rất nhiều đặc tính mong muốn không xuất hiện ở giai đoạn thụ phấn nên một số cây được chọn lại lúc thu hoạch. Chỉ những cây có đặc điểm mong muốn trong số con cháu tốt được sử dụng cho quá trình tạo dòng tiếp theo. Sau 3 hoặc 4 đời tự phối, những dòng còn sống sót qua quá trình chọn lọc sẽ phân chia thành những dạng khác nhau và được đánh giá về những đặc điểm nông học và xác định khả năng kết hợp.
1.8.2. Phương pháp Sib (cận phối) hoặc Fullsib (cận phối giữa chị em)
Stringfield [75] đã đề xuất phương pháp Sib và sử dụng để tạo dòng nhằm làm giảm mức độ suy thoái do tự phối gây nên, tuy nhiên phương pháp này sẽ kéo dài thời gian chọn lọc dòng. Ngô Hữu Tình và Nguyễn Thế Hùng [18], đã sử dụng phương pháp Fullsib, dạng cải tiến của phương pháp Sib để tạo dòng và đã thành công trong việc tạo ra một số dòng từ nguồn vật liệu là quần thể chọn lọc SB 2649. Tuy nhiên, phương pháp Sib hoặc Fullsib có cường độ tự phối thấp, quá trình đạt đến độ đồng hợp tử chậm hơn và có hệ số biến dị lớn hơn, tạo ra nhiều cơ hội để chọn lọc giữa và trong số các dòng con cháu.
1.8.3. Phương pháp chọn lọc phả hệ (Pedigree selection)
Phương pháp này được thực hiện từ một cặp lai trong một mô hình ưu thế lai, dựa trên thành tích đã được chứng minh trong thương mại để lựa chọn các dòng bố mẹ. Một quần thể F2 được hình thành, sau đó tự phối một vài thế hệ bằng cách sử dụng bắp trên hàng với mỗi gia đình để tìm lại các cây F2. Trong quá trình giao phối cận huyết, những kiểu gen khiếm khuyết được loại bỏ. Lai thử sớm thực hiện ở thế hệ S2 bằng các lai đỉnh giữa các dòng S2 với một dòng tự phối từ mỗi nhóm ưu thế lai chính. Các tổ hợp lai từ thí nghiệm lai đỉnh trên được đánh giá đặc tính sinh trưởng và phát triển trong điều kiện giới hạn, những dòng S2 được chọn sẽ được sử dụng tiếp theo trong chương trình chọn giống. Các gia đình S2 được lựa chọn tiếp tục được tự phối đến S5,
34
sau đó lại tiến hành các thí nghiệm lai đỉnh một lần nữa, các tổ hợp lai lại được đánh giá tương tự như lần đầu. Các quần thể F2 được sử dụng rộng rãi để phát triển dòng thuần (37%); các quần thể có nền di truyền rộng (15%), quần thể có nền di truyền hẹp (16%); các quần thể cải thiện các đặc tính đặc biệt và quần thể từ các dòng ưu tú có quan hệ họ hàng (14%)[27].
Các nhà khoa học trên thế giới như Duvick [35], Mikel và Dudley [62], Lee và Tollenaar [77] cho rằng: Hầu hết các hoạt động phát triển dòng tự phối sử dụng phương pháp chọn tạo phả hệ.
Chọn tạo phả hệ phụ thuộc vào kỹ năng của các nhà chọn giống, mục tiêu chọn tạo và nguồn lực. Mỗi nhà chọn giống lại có những lựa chọn riêng cho những đặc điểm ở từng giai đoạn của quá trình giao phối cận huyết. Cường độ chọn lọc sẽ khác nhau tùy thuộc vào mức độ chọn lọc, điều kiện và dạng vật liệu lựa chọn.
Bauman [28], Duvick [36], Hallauer [42] cho rằng, chọn lọc phả hệ là một thành phần quan trọng trong chương trình chọn tạo giống hiện đại, nó sẽ là điểm nhấn trong quần thể với sự hạn chế của cơ sở di truyền các giống lai và các dòng tốt là cơ sở để cải tiến các dòng thông qua chọn lọc phả hệ. Gần đây, chọn lọc phả hệ trong các quần thể phân ly của các cặp lai từ những dòng ưu tú đã trở thành phương pháp tạo dòng ngày càng phổ biến [13]. Hiện nay, các nhà chọn giống ngô Việt Nam vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp này để tạo dòng thuần.
1.8.4. Tạo dòng đơn bội kép (Double haploid - DH)
Việc chọn tạo dòng thuần bằng phương pháp truyền thống mất rất nhiều thời gian (3 - 4 năm). Các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp nuôi cấy invitro để tạo ra các dòng đơn bội kép (double halploid), các dòng mới được tạo ra trong thời gian rất ngắn (1 - 2 năm) và có độ thuần cao (homozygous lines).
35
Cây đơn bội có thể tạo ra bằng nhiều cách khác nhau: Trong ống nghiệm thông qua hạt phấn (microspore) [66]; nuôi cấy bao phấn [27] hoặc sử dụng các dòng cảm ứng (kích tạo đơn bội). Có một vài dòng cảm ứng đã được sử dụng để tạo các dòng đơn bội kép: Stock 6 [33], RWS [69], KEMS [34], UH400 [57], KMS và ZMS [30]. Hầu hết các dòng đơn bội kép trong chọn tạo giống ngô thương mại đều được tạo ra bằng cách sử dụng dòng mẹ cảm ứng. Trong khi các dòng cảm ứng đầu tiên như Stock 6 chỉ tạo ra tỷ lệ đơn bội khoảng 3%, các dòng cảm ứng sử dụng trong thương mại có tần số cảm ứng đơn bội đến gần 10%. Để tạo các mẹ đơn bội, dòng cảm ứng thường được sử dụng để cho phấn (làm donor) và thường được nhìn thấy ở dạng cây đột biến lặn được kết hợp vào các nguồn gen từ đó hình thành đơn bội. Bất kể cơ chế tạo ra đơn bội nào, sự lưỡng bội bộ nhiễm sắc thể có thể do tự phát, sử dụng các oxit nitơ hoặc colchicines [39], [50].
* Phương pháp tạo dòng bằng nuôi cấy noãn ngô
Phương pháp tạo dòng ngô đơn bội kép bằng nuôi cấy noãn ngô in vitro
đã được đề cập và nghiên cứu từ đầu những năm 80 của thế kỷ 20 [23], [24], [79]. Nhóm tác giả đã nghiên cứu tạo mô sẹo (callus) từ noãn ngô chưa thụ tinh, sau đó tái sinh cây từ các callus thu được. Nghiên cứu các dòng thuần được tạo ra bằng phương pháp này ở mức phân tử cho thấy cây ngô được tái sinh là do tế bào trứng chưa thụ tinh tự lưỡng bội hóa tạo thành. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh phụ thuộc rất lớn vào khả năng sinh sản đơn tính cái đại bào tử (megaspore - gynogenesis) của các nguồn vật liệu nuôi cấy. Tỷ lệ phản ứng tạo callus và khả năng tái sinh thành cây không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen (genotypes) mà còn phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng, chất lượng của vật liệu cho noãn và kỹ thuật nuôi cấy nên hiệu quả của quá trình nuôi cấy còn thấp, vì vậy phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi.
36
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nuôi cấy noãn ngô cũng đã được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu ngô, các nghiên cứu đã tập trung chủ yếu vào việc xác định các công thức môi trường và các nguồn vật liệu cho phản ứng tạo callus và tái sinh cây cao[6], [9], [10].
* Phương pháp tạo dòng bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn tách rời
Trên thế giới, phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô được Anonymous nghiên cứu từ năm 1975 [52], sau đó tiếp tục được hoàn thiện bởi Chu [30], Kuo và cs [53]. Cấu trúc dạng phôi (embryo structure) hình thành từ nuôi cấy hạt phấn tách rời ở ngô cũng đã được nghiên cứu từ cuối những năm 80, đầu những năm 90 của thế kỷ trước [63], [66], [67]. Đã có nhiều tác giả báo cáo kết quả về sự tái sinh thành công cây ngô đơn bội từ tiểu bào tử ở ngô như: Pescitelli và cs [66], Obert và cs [64], Szarka và cs [76]. Những nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời ở ngô có tầm quan trọng rất lớn trong việc nhanh chóng tạo ra các dòng ngô thuần (hay còn gọi là dòng đơn bội kép - double haploid lines) phục vụ công tác tạo giống ngô lai [25], [40], [41], [60], [63].
Ở Việt Nam, phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô bắt đầu được quan tâm nghiên cứu trong khoảng 15 năm trở lại đây và đã thu được một số kết quả nhất định [2], [8], [9] [10]). Những nghiên cứu cải tiến quy trình nuôi cấy bao phấn như: xử lý lạnh bao phấn trước và sau khi cấy, cải tiến thành phần muối khoáng trong môi trường nuôi cấy, bổ sung các thành phần hữu cơ..vv. nhằm nâng cao tỷ lệ tạo phôi và tái sinh cây cũng đã được đề cập [5], [8], [9]. Phương pháp truyền tính cảm ứng bằng cách sử dụng bao phấn của con lai F1 giữa các nguồn vật liệu có tỷ lệ phản ứng cao và các nguồn vật liệu có tỷ lệ phản ứng thấp hoặc không phản ứng đã nâng cao được tỷ lệ tạo phôi và tái sinh cây lên hàng chục lần. Trong giai đoạn 1996 - 1998, các kết quả nghiên
37
cứu tạo cấu trúc phôi và tái sinh cây từ bao phấn tại Viện Nghiên cứu Ngô cho kết quả: tỷ lệ phản ứng tạo cấu trúc phôi trung bình chỉ đạt 4%, tỷ lệ tái sinh cây khoảng 2,1%. Bằng phương pháp truyền tính cảm ứng, cải tiến các nguồn vật liệu đã nâng tỷ lệ tạo phôi lên 10% và tỷ lệ tái sinh cây lên 11 %, đặc biệt đã chọn tạo được một số nguồn vật liệu có tỷ lệ tạo phôi trên 30% và tỷ lệ tái sinh cây trên 14%. Hiện nay, hướng nghiên cứu nâng cao tỉ lệ tạo phôi, tái sinh cây và khai thác các nguồn vật liệu để tạo dòng có giá trị thương mại đang tiếp tục được triển khai nghiên cứu.
* Tạo dòng bằng cây kích tạo đơn bội
Các đơn bội (DH) cho phép phát triển nhanh chóng của các dòng ngô