Việc chọn tạo dòng thuần bằng phương pháp truyền thống mất rất nhiều thời gian (3 - 4 năm). Các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp nuôi cấy invitro để tạo ra các dòng đơn bội kép (double halploid), các dòng mới được tạo ra trong thời gian rất ngắn (1 - 2 năm) và có độ thuần cao (homozygous lines).
35
Cây đơn bội có thể tạo ra bằng nhiều cách khác nhau: Trong ống nghiệm thông qua hạt phấn (microspore) [66]; nuôi cấy bao phấn [27] hoặc sử dụng các dòng cảm ứng (kích tạo đơn bội). Có một vài dòng cảm ứng đã được sử dụng để tạo các dòng đơn bội kép: Stock 6 [33], RWS [69], KEMS [34], UH400 [57], KMS và ZMS [30]. Hầu hết các dòng đơn bội kép trong chọn tạo giống ngô thương mại đều được tạo ra bằng cách sử dụng dòng mẹ cảm ứng. Trong khi các dòng cảm ứng đầu tiên như Stock 6 chỉ tạo ra tỷ lệ đơn bội khoảng 3%, các dòng cảm ứng sử dụng trong thương mại có tần số cảm ứng đơn bội đến gần 10%. Để tạo các mẹ đơn bội, dòng cảm ứng thường được sử dụng để cho phấn (làm donor) và thường được nhìn thấy ở dạng cây đột biến lặn được kết hợp vào các nguồn gen từ đó hình thành đơn bội. Bất kể cơ chế tạo ra đơn bội nào, sự lưỡng bội bộ nhiễm sắc thể có thể do tự phát, sử dụng các oxit nitơ hoặc colchicines [39], [50].
* Phương pháp tạo dòng bằng nuôi cấy noãn ngô
Phương pháp tạo dòng ngô đơn bội kép bằng nuôi cấy noãn ngô in vitro
đã được đề cập và nghiên cứu từ đầu những năm 80 của thế kỷ 20 [23], [24], [79]. Nhóm tác giả đã nghiên cứu tạo mô sẹo (callus) từ noãn ngô chưa thụ tinh, sau đó tái sinh cây từ các callus thu được. Nghiên cứu các dòng thuần được tạo ra bằng phương pháp này ở mức phân tử cho thấy cây ngô được tái sinh là do tế bào trứng chưa thụ tinh tự lưỡng bội hóa tạo thành. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh phụ thuộc rất lớn vào khả năng sinh sản đơn tính cái đại bào tử (megaspore - gynogenesis) của các nguồn vật liệu nuôi cấy. Tỷ lệ phản ứng tạo callus và khả năng tái sinh thành cây không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen (genotypes) mà còn phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng, chất lượng của vật liệu cho noãn và kỹ thuật nuôi cấy nên hiệu quả của quá trình nuôi cấy còn thấp, vì vậy phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi.
36
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nuôi cấy noãn ngô cũng đã được tiến hành tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu ngô, các nghiên cứu đã tập trung chủ yếu vào việc xác định các công thức môi trường và các nguồn vật liệu cho phản ứng tạo callus và tái sinh cây cao[6], [9], [10].
* Phương pháp tạo dòng bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn tách rời
Trên thế giới, phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô được Anonymous nghiên cứu từ năm 1975 [52], sau đó tiếp tục được hoàn thiện bởi Chu [30], Kuo và cs [53]. Cấu trúc dạng phôi (embryo structure) hình thành từ nuôi cấy hạt phấn tách rời ở ngô cũng đã được nghiên cứu từ cuối những năm 80, đầu những năm 90 của thế kỷ trước [63], [66], [67]. Đã có nhiều tác giả báo cáo kết quả về sự tái sinh thành công cây ngô đơn bội từ tiểu bào tử ở ngô như: Pescitelli và cs [66], Obert và cs [64], Szarka và cs [76]. Những nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời ở ngô có tầm quan trọng rất lớn trong việc nhanh chóng tạo ra các dòng ngô thuần (hay còn gọi là dòng đơn bội kép - double haploid lines) phục vụ công tác tạo giống ngô lai [25], [40], [41], [60], [63].
Ở Việt Nam, phương pháp nuôi cấy bao phấn ngô bắt đầu được quan tâm nghiên cứu trong khoảng 15 năm trở lại đây và đã thu được một số kết quả nhất định [2], [8], [9] [10]). Những nghiên cứu cải tiến quy trình nuôi cấy bao phấn như: xử lý lạnh bao phấn trước và sau khi cấy, cải tiến thành phần muối khoáng trong môi trường nuôi cấy, bổ sung các thành phần hữu cơ..vv. nhằm nâng cao tỷ lệ tạo phôi và tái sinh cây cũng đã được đề cập [5], [8], [9]. Phương pháp truyền tính cảm ứng bằng cách sử dụng bao phấn của con lai F1 giữa các nguồn vật liệu có tỷ lệ phản ứng cao và các nguồn vật liệu có tỷ lệ phản ứng thấp hoặc không phản ứng đã nâng cao được tỷ lệ tạo phôi và tái sinh cây lên hàng chục lần. Trong giai đoạn 1996 - 1998, các kết quả nghiên
37
cứu tạo cấu trúc phôi và tái sinh cây từ bao phấn tại Viện Nghiên cứu Ngô cho kết quả: tỷ lệ phản ứng tạo cấu trúc phôi trung bình chỉ đạt 4%, tỷ lệ tái sinh cây khoảng 2,1%. Bằng phương pháp truyền tính cảm ứng, cải tiến các nguồn vật liệu đã nâng tỷ lệ tạo phôi lên 10% và tỷ lệ tái sinh cây lên 11 %, đặc biệt đã chọn tạo được một số nguồn vật liệu có tỷ lệ tạo phôi trên 30% và tỷ lệ tái sinh cây trên 14%. Hiện nay, hướng nghiên cứu nâng cao tỉ lệ tạo phôi, tái sinh cây và khai thác các nguồn vật liệu để tạo dòng có giá trị thương mại đang tiếp tục được triển khai nghiên cứu.
* Tạo dòng bằng cây kích tạo đơn bội
Các đơn bội (DH) cho phép phát triển nhanh chóng của các dòng ngô đồng hợp tử hoàn toàn và cung cấp những cơ hội đáng kể cho sự phát triển nhanh chóng và phát hành các giống ưu tú. Bên cạnh đó nó giúp rút ngắn thời gian và giảm chi phí để tạo dòng thuần. Tạo dòng DH liên quan đến bốn bước chính: (1) Trong cảm ứng vivohaploid; (2) xác định hạt giống đơn bội bằng cách sử dụng các dấu hiệu hình thái; (3) nhiễm sắc thể tăng gấp đôi haploids giả định; và (4) tạo D1 (DH) hạt giống từ cây D0.
Chương trình ngô toàn cầu CIMMYT, phối hợp Đại học Hohenheim (UHo) để tạo cây DH nhiệt đới và đã thành công. Hiện nay, những dòng DH nhiệt đới tại CIMMYT có cảm ứng cao trong tạo hạt đơn bội đạt (~ 8-10%) và hiệu suất nông học tốt hơn so với cây DH ôn đới.
Tại Việt Nam, năm 2013 cây DH nhiệt đới và công nghệ sản xuất dòng đơn bội kép đã được CIMMYT chuyển giao cho Viện Nghiên cứu Ngô. Hiện nay, công nghệ này đã được ứng dụng cho việc tạo dòng thuần ngô và bước đầu thu được các kết quả tốt. Một số tổ hợp lai triển vọng có sự tham gia của dòng thuần tạo từ cây kích tạo đơn bội, cho năng suất cao và có độ đồng đều hơn hẳn các tổ hợp lai từ các dòng tạo được bằng phương pháp truyền thống.
38