sinh
Sắc ký
Sắc ký được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254, ở nhiệt độ 250C, với dung môi di chuyển cloroform:metanol:acid acetic (80:15:5 theo thể tích) (Yokota et al 1980).
Xác định vị trí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký
Vị trí AIA và ABA trên bản sắc khí được xác định trực tiếp dưới tia UV. Vị trí GA3 được phát hiện bằng cách phun hổn hợp acid sulfuric-ethanol (5:95), sấy ở 100 – 1100C trong 10 phút và quan sát dưới đèn UV (Yokota et al
1980).
Tạo các dung dịch để dùng trong sinh trắc nghiệm
Sau khi chạy sắc ký, dựa trên vị trí chất chuẩn đã ghi nhận, cắt đúng Rf tương ứng ở mẫu, ngâm với 10ml nước cất trong 24 giờ trước khi dùng trong sinh trắc nghiệm. Chuẩn là dịch trích băng silicagel dưới mực gốc.
Sinh trắc nghiệm Auxin và acid abscissic
Hoạt tính auxin và abscissic được đo nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) (Bùi Trang Việt 1992). Diệp tiêu của cây mạ Lúa (trong tối, sau 72 ± 2 giờ, khi bao diệp tiêu chưa bị xé) được cắt thành khúc ngắn 2mm. 10 khúc cắt được ngâm vào đĩa Petri chứa dịch trích, sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, ở 27 ± 10
C. Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài các khúc cắt so với chuẩn. Hoạt tính abscissic acid tỷ lệ nghịch với sự sai biệt chiều dài các khúc cắt diệp tiêu so với chuẩn. Hoạt tính của auxin và abscissic acid được tính bằng cách so sánh với các dung dịch IAA 1mg/l và ABA 1mg/l. Hoạt tính tổng cộng của auxin là tổng các trị số dương. Hoạt tính tổng cộng của các chất cản là tổng các trị số âm.
Cytokinin
Hoạt tính của cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp Dưa chuột (Cucumis sativus L.) (Thomas và cs trong Bùi Trang Việt 1992). Hạt Dưa leo được cho nảy mầm, khi rễ mầm nhú ra khoảng 2mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với sự sai biệt trọng lượng tươi của các tử diệp so với chuẩn và Zeatin 1mg/l, sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200lux) ở nhiệt độ 29 ± 20C, độ ẩm không khí 70 – 80%. Hoạt tính tổng cộng của cytokinin là tổng các trị số dương.
Gibberelline
Hoạt tính gibberelline được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách được trồng ở nhiệt độ 29 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200lux, độ ẩm không khí 70 – 80% (Meidner, 1984). Hoạt tính gibberelline tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn sau 5 ngày xử lý và được tính bằng cách so sánh với dung dịch GA3 tinh khiết 10mg/l. Hoạt tính tổng cộng của gibberelline là tổng các trị số dương.
2.2.8.Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong quá trình tạo mô sẹo
Từ kết quả đo sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng tưởng thực vật nội sinh trong quá trình tạo mô sẹo, phương pháp này nhằm đánh giá hiệu quả của 2,4- D và BA ngoại sinh ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tạo mô sẹo qua sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy tạo mô sẹo.
Cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MSthành những khúc cắt 1 – 2 mm (Hình 2.4).
Đặt các khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) cây Sưa in vitro sau 1 tuần tuổitrên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D (ở các nồng độ 1; 2; 3mg/l) và BA (ở các nồng độ 0,5; 1mg/l) để tạo sẹo (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro.
Nồng độ các CĐHTTTV (mg/l) 2,4-D BA 1 0,5 1 1 2 0,5 2 1 3 1
Các mẫu nuôi cấy được đặt trong tối ở nhiệt độ 240
C ± 10C, độ ẩm 68%. Theo dõi sự tăng trưởng của mẫu cấy theo thời gian. Kết quả sự tăng trưởng của mẫu cấy tạo mô sẹo trong 3 tuần được cân trực tiếp để xác định sự tăng trưởng theo sự thay đổi trọng lượng tươi. Sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy là kết quả của sự ảnh hưởng của nồng độ auxin và cytokinin ngoại sinhlên quá trình tạo mô sẹo của mẫu cấy.