2.2.7.1. Ly trích
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có trong mẫu được ly trích và phân đoạn theo Bùi Trang Việt (1992).
Nghiền 1g vật liệu tươi (mô sẹo hoặcmẫu cấy phát sinh cơ quan) ngâm trong 10ml metanol 80%, để qua đêm. Lọc, phần bã được rửa 2 lần với 10ml metanol 80%. Cô cặn dịch lọc,phần cặn được hòa tan trong 5ml nước cất. Sự trích và phân đoạn được trình bày tóm tắt trong (Hình2.3).
Quạt khô Dịch eter Dịch nước (bỏ) NaHCO3 8% Quạt cạn Chấm sắc kí Chạy sắc kí Sinh trắc nghiệm Auxin, ABA, GA Dịch n-butanal Sinh trắc nghiệm Cytokinin + 10ml nước cất Nghiền mẫu (1g) Lọc (3 lần) + 10ml Methanol 80% lắc (để tối 24 giờ) Dịch nước Bã (bỏ) Quạt cạn + 5ml nước cất, HCl 1%, pH 2,5, + 10ml eter Dịch eter Dịch lọc
Dịch eter Dịch eter Dịch nước
NaOH 1N, pH 7.0 +10ml n-butanol + 10ml eter
2.2.7.2. Phân đoạn và đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh sinh
Sắc ký
Sắc ký được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254, ở nhiệt độ 250C, với dung môi di chuyển cloroform:metanol:acid acetic (80:15:5 theo thể tích) (Yokota et al 1980).
Xác định vị trí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên bản sắc ký
Vị trí AIA và ABA trên bản sắc khí được xác định trực tiếp dưới tia UV. Vị trí GA3 được phát hiện bằng cách phun hổn hợp acid sulfuric-ethanol (5:95), sấy ở 100 – 1100C trong 10 phút và quan sát dưới đèn UV (Yokota et al
1980).
Tạo các dung dịch để dùng trong sinh trắc nghiệm
Sau khi chạy sắc ký, dựa trên vị trí chất chuẩn đã ghi nhận, cắt đúng Rf tương ứng ở mẫu, ngâm với 10ml nước cất trong 24 giờ trước khi dùng trong sinh trắc nghiệm. Chuẩn là dịch trích băng silicagel dưới mực gốc.
Sinh trắc nghiệm Auxin và acid abscissic
Hoạt tính auxin và abscissic được đo nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) (Bùi Trang Việt 1992). Diệp tiêu của cây mạ Lúa (trong tối, sau 72 ± 2 giờ, khi bao diệp tiêu chưa bị xé) được cắt thành khúc ngắn 2mm. 10 khúc cắt được ngâm vào đĩa Petri chứa dịch trích, sự gia tăng chiều dài của diệp tiêu được đo sau 24 giờ, trong tối, ở 27 ± 10
C. Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài các khúc cắt so với chuẩn. Hoạt tính abscissic acid tỷ lệ nghịch với sự sai biệt chiều dài các khúc cắt diệp tiêu so với chuẩn. Hoạt tính của auxin và abscissic acid được tính bằng cách so sánh với các dung dịch IAA 1mg/l và ABA 1mg/l. Hoạt tính tổng cộng của auxin là tổng các trị số dương. Hoạt tính tổng cộng của các chất cản là tổng các trị số âm.
Cytokinin
Hoạt tính của cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp Dưa chuột (Cucumis sativus L.) (Thomas và cs trong Bùi Trang Việt 1992). Hạt Dưa leo được cho nảy mầm, khi rễ mầm nhú ra khoảng 2mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với sự sai biệt trọng lượng tươi của các tử diệp so với chuẩn và Zeatin 1mg/l, sau 48 giờ chiếu sáng (2000 ± 200lux) ở nhiệt độ 29 ± 20C, độ ẩm không khí 70 – 80%. Hoạt tính tổng cộng của cytokinin là tổng các trị số dương.
Gibberelline
Hoạt tính gibberelline được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách được trồng ở nhiệt độ 29 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200lux, độ ẩm không khí 70 – 80% (Meidner, 1984). Hoạt tính gibberelline tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn sau 5 ngày xử lý và được tính bằng cách so sánh với dung dịch GA3 tinh khiết 10mg/l. Hoạt tính tổng cộng của gibberelline là tổng các trị số dương.
2.2.8.Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong quá trình tạo mô sẹo
Từ kết quả đo sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng tưởng thực vật nội sinh trong quá trình tạo mô sẹo, phương pháp này nhằm đánh giá hiệu quả của 2,4- D và BA ngoại sinh ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tạo mô sẹo qua sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy tạo mô sẹo.
Cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MSthành những khúc cắt 1 – 2 mm (Hình 2.4).
Đặt các khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) cây Sưa in vitro sau 1 tuần tuổitrên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D (ở các nồng độ 1; 2; 3mg/l) và BA (ở các nồng độ 0,5; 1mg/l) để tạo sẹo (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro.
Nồng độ các CĐHTTTV (mg/l) 2,4-D BA 1 0,5 1 1 2 0,5 2 1 3 1
Các mẫu nuôi cấy được đặt trong tối ở nhiệt độ 240
C ± 10C, độ ẩm 68%. Theo dõi sự tăng trưởng của mẫu cấy theo thời gian. Kết quả sự tăng trưởng của mẫu cấy tạo mô sẹo trong 3 tuần được cân trực tiếp để xác định sự tăng trưởng theo sự thay đổi trọng lượng tươi. Sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy là kết quả của sự ảnh hưởng của nồng độ auxin và cytokinin ngoại sinhlên quá trình tạo mô sẹo của mẫu cấy.
2.2.9. Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo
2.2.9.1. Khảo sát khối lượng mô sẹo ảnh hưởng đến sự tạo dịch treo tế bào của cây Sưa in vitro cây Sưa in vitro
Chuyển 2,0 gam, 1,0 gamvà 500 mg mô sẹo (phần mềm, dễ tách rời) 3 tuần tuổi từ môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l) sang erlen 50ml có chứa 10ml môi trường lỏng với thành phần môi trường tượng tự như môi trường tạo mô sẹo, được lắc ở vận tốc 80vòng/phút, ở trong tối, ở nhiệt độ 24 ± 20C, độ ẩm 68 ± 5%. Theo dõi sự phát triển của dich treo tế bào theo thời gian. Hình thái tế bào (Dalbergia tonkinensis Prain in vitro) được quan sát dưới kính hiển vi quang học.
2.2.9.2. Khảo sát nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật ảnh hưởng
đến quá trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro
Chuyển 500 mg mô sẹo (phần mềm, dễ tách rời) 3 tuần tuổi từ môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l) sang erlen 50ml có chứa 10ml môi trường lỏng với thành phần môi trường có bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng thực vật thay đổi như sau ( Bảng 2.4):
Bảng 2.4. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo từ cây Sưa in vitro.
Nồng độ các CĐHTTTV (mg/l) 2,4-D BA 1 0,5 1 1 2 0,5 2 1 3 1
Các erlen được đặt trên máy lắc với vận tốc 80vòng/phút, ở trong tối, ở nhiệt độ 24 ± 20C, độ ẩm 68 ± 5%. Theo dõi sự phát triển của dich treo tế bào theo thời gian. Hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học.
2.2.10. Phân tích số liệu
Các số liệu thí nghiệm được xử lí thống kê bằng chương trình Microsoft Office Excel 2007, và chương trình SPSS (Statistical Program Scientific System) dùng cho Window phiên bản 11.5, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95%
Các nghiệm thứctrong thí nghiệm được thực hiệnvới 3 lần lặp lại. Đề tài được tiến hành từ tháng 01/2012 tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường ĐHSP TP Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả
3.1.1. Nuôi cấy tạo cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro
Sau một tuần nuôi cấy, phôi cây Sưa phát triển tốt trên môi trường MS, cây con xanh, khoẻ, đạt kích thước 3,5 cm (Hình 3.1).
3.1.2. Sự tạo mô sẹo
3.1.2.1. Sự tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro
Sau 1 tuần, các mẫu nuôi cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro 1 tuần tuổi đã xuất hiện mô sẹo hầu hết các môi trường (trừ môi trường MS (Hình 3.2)) và tiếp tục gia tăng kích thước, trọng lượng theo thời gian (Hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10 và 3.11).
Hình 3.2. Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro1 tuần tuổi trên môi trường MS sau 1 tuần, không hình thành mô sẹo.
Hình 3.3. Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l.
Hình 3.5.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) củacây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3 /l
Hình 3.4.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D
Hình 3.6.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 1mg/l và BA 0,5 mg/l.
Hình 3.7.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 1mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.8.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l.
Hình 3.9.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 2mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.10.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 3mg/l và BA 0,5mg/l.
Hình 3.11.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 3mg/l và BA 1mg/l.
Sau 2 tuần, mô sẹo trên các mô trường bắt đầu có sự biến đổi khác nhau: Trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ 1; 2; 3mg/l, mô sẹo tăng sinh, màu vàng nhạt, bở.Trên các mô trường MS có bổ sung 2,4-D (ở các nồng độ 1; 2; 3mg/l) và BA (ở các nồng độ 0,5; 1mg/l) mô sẹo tăng sinh, màu vàng xanh nhạt, mềm (Hình 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18, 3.19). Ngoại trừ trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/lmô sẹo đã hoá nâu (Hình 3.20).
Hình 3.12.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 1mg/l.
Hình 3.13.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 2mg/l.
Hình 3.14.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 3mg/l.
Hình 3.15.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 1mg/l và BA 0,1mg/l.
Hình 3.16.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 1mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.17.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 2mg/l và BA 0,5mg/l.
Hình 3.18.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 3mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.19.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 3mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.20.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4- D 3mg/l và BA 0,5mg/l.
Sau 3 tuần, mô sẹo trên các môi trường biến đổi khác nhau rất rõ. Trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D (các nồng độ 1; 2; 3mg/l), mô sẹo tăng sinh ít, màu xanh nhạt, mềm, bở, (Hình3.21, 3.22, 3.23). Trên các mô trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 2,4-D (ở các nồng độ 1; 2; 3mg/l) và BA (ở các nồng độ 0,5; 1mg/l) mô sẹo tăng sinh, mềm, và bắt đầu hoá nâu (Hình 3.24, 3.25, 3.26, 3.27). Tuy nhiên trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l mô sẹo tăng sinh mạnh nhất (Hình 3.28). Trên môi trường MS các mẫu cấy không thay đổi (Hình 3.29).
Môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l được chọn là môi trường tạo sẹo và mô sẹo trên môi trường này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau. Thời gian cấy chuyền vào tuần thứ 3.
Hình 3.21.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l.
Hình 3.23.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l.
Hình 3.22.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l.
Hình 3.24.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5 mg/l.
Hình 3.25.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) củacây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.26.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l.
Hình 3.27.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.28.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l.
Hình 3.29. Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitrotrên môi trường MS sau 3 tuần, không hình thànhmô sẹo.
3.1.2.2. Sự tăng trưởng của mô sẹo
Tăng trưởng của mô sẹo từ mẫu cấy ban đầu
Kết quả thí nghiệm cho thấy, trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l, các mẫu khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro hình thành mô sẹo sau một tuần nuôi cấy, trọng lượng tươi của mô sẹo tăng dần từ tuần thứ 2 và tuần thứ 3 và ổn định ở tuần thứ 4. Trọng lượng khô của mô sẹo cũng gia tăng tương ứng (Bảng 3.1,Hình 3.30).
Bảng 3.1. Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô của mô sẹo có nguồn gốc từ khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro theo thời gian nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l.
Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg)
0 3,67 ± 0,38a 0,40 ± 0,10a 1 19,60 ± 3,18b 1,87 ± 0,27b 2 78,13 ± 1,54c 7,07 ± 0,15c 3 145,83 ± 3,85d 12,37 ± 0,26d 4 157,97 ± 2,32e 15,07 ± 0,29e 5 150,10 ± 2,08d 14,87 ± 0,41e
Các số trung bình trong cột với mẫu kí tự chữ khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa mức p=0,05.
Tăng trưởng của mô sẹo sau khi được cấy chuyền
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00