3. Đối t−ợng, nguyên liệu, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.3.1.2. Ph−ơng pháp xác định số loại và số l−ợng vi khuẩn trong phân chó
a. Xác định số l−ợng vi khuẩn
Chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp Koch: cấy vi khuẩn trong môi tr−ờng thạch cứng rồi đếm số l−ợng khuẩn lạc (CFU). Số l−ợng CFU t−ơng đ−ơng với số l−ợng vi khuẩn.
b. Tính kết quả
Cấy 0,1ml mẫu pha loãng trên một đĩa petri, sau nuôi cấy 37oC/ 24h đếm số khuẩn lạc rồi tính kết quả theo công thức sau:
Số l−ợng vi khuẩn có trong 1g phân là: X = 10.a.b
Trong đó X: số vi khuẩn trong 1 gam phân.
a: số l−ợng CFU trung bình trên 1 đĩa petri b: nồng độ pha loãng
c. Xác định số loại vi khuẩn th−ờng gặp trong phân chó
Mỗi loại vi khuẩn khi mọc trên môi tr−ờng thạch th−ờng có một đặc tính mọc khác nhau. Trên cơ sở đó có thể phân loại và xác định đ−ợc số l−ợng
của từng loại. Thông qua việc phân loại CFU qua hình thái, kích th−ớc, màu sắc, dạng khuẩn lạc (S, M, R), đếm số l−ợng từng loại. Sau đó tiến hành phân lập giám định các khuẩn lạc đó bằng cách chọn các khuẩn lạc điển hình cho từng loại vi khuẩn cấy sang các môi tr−ờng chuyên dụng.
3.4.3. Ph−ơng pháp phân lập giám định từng loại vi khuẩn
Việc dùng phân để phân lập các vi khuẩn đ−ờng ruột là một việc làm rất phức tạp, vì trong phân có nhiều loại vi khuẩn khác nhau và số l−ợng cũng rất lớn. Chúng tôi sử dụng các loại môi tr−ờng môi tr−ờng chuyên dụng để phân lập và giám định từng loại vi khuẩn. Tiếp đến tiến hành thuần khiết rồi chuyển sang môi tr−ờng thạch máu để giữ giống.
3.4.4. Kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của Salmonella spp, E.coli
phân lập từ phân chó viêm ruột tiêu chảy do vi khuẩn với một số thuốc kháng sinh và thuốc hoá học trị liệu bằng ph−ơng pháp làm kháng sinh đồ
Các loại giấy tẩm kháng sinh đ−ợc sử dụng làm kháng sinh đồ theo ph−ơng pháp khuếch tán trên thạch Antibiotic Agar (Oxoid) dựa theo nguyên lí của Kirby - Bauer (Bauer, 1966).
Vi khuẩn gây bệnh sau khi phân lập thuần khiết, đ−ợc nuôi ở n−ớc thịt 37o
C/24h. Chuẩn bị môi tr−ờng, giấy tẩm kháng sinh: giấy tẩm kháng sinh đ−ợc bảo quản ở 9oC. Tr−ớc khi sử dụng, lấy giấy ra ngoài cho cân bằng với nhiệt độ phòng.
Cách làm: dàn đều vi khuẩn lên mặt thạch bằng đáy ống nghiệm vô trùng. Đợi 3 - 5 phút (không quá 15 phút) cho ráo mặt thạch. Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên bề mặt thạch bằng một pink kẹp vô trùng. Không dịch chuyển khoanh giấy khi nó đã tiếp xúc với mặt thạch. Dùng đầu pink ấn nhẹ khoanh giấy để đảm bảo khoanh giấy tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Các khoanh giấy đặt cạnh nhau ít nhất 24 mm t−ơng đ−ơng 6 khoanh trên 1 đĩa đ−ờng kính 90 mm. Đợi khoảng 15 phút, đặt vào tủ ấm 37oC/16 - 18h.
Sau khi nuôi cấy ở tủ ấm 37oC/16 - 18h, đo đ−ờng kính vòng vô khuẩn bằng th−ớc mm. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đọc đ−ờng kính lớn nhất, nhỏ nhất rồi cộng chia trung bình. Đ−ờng kính của vòng vô khuẩn đ−ợc tính ra mm và đ−ợc đánh giá: mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I), hay kháng (R). Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
Đánh giá đ−ờng kính vòng vô khuẩn dựa theo bảng sau
Đ−ờng kính vòng vô khuẩn (mm) Loại kháng sinh Kí hiệu L−ợng kháng
sinh (àg) R (≤) I H(≥) Ciprofloxacin Cip 15 15 16 - 20 21 Norfloxacin Nor 10 12 13 - 16 17 Ofloxacin Ofx 5 12 13 - 16 17 Nitrofurantoin 300UI 14 13 - 16 17 Polymycin B 300UI 8 7 - 12 13 Chloramphenicol CM 30 12 13 - 17 18 Gentamycin GM 10 12 13 - 14 15 Erythromycin E 15 13 14 - 22 23 Ampicillin AM 10 11 12 - 13 14 Amoxicillin/
Clavulanic acid AMC 20/10 13 14 - 17 18
Sulfamethoxazol –
Trimethoprim SXT 1,25/23,75 10 11 - 15 16
Penicillin* P 10UI 11 12 - 21 22
Bảng ý nghĩa vòng vô khuẩnNguồn: Oxoid từ NCCLS (1990) M2 A4(Oxoid, 1982) [53]
Ghi chú: Penicillin*: đối chứng (-) để kiểm tra lại kết quả phân lập, H (High): mẫn cảm cao, I (Intermediate): mẫn cảm trung bình, R (Resistant): kháng.
Toàn bộ thí nghiệm đ−ợc bố trí theo sơ đồ sau:
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Phân chó bình th−ờng Mẫu Phân chó tiêu chảy
Pha loãng 10x
Thạch th−ờng
Đếm tổng số CFU Số loại khuẩn lạc Số l−ợng khuẩn
lạc từng loại Khuẩn lạc điển hình Các môi tr−ờng chuyên dụng MacConkey (Salmonella và E.coli) BGA (Salmonella, E.coli) Chapman (Staphylococcus) Edwards (Streptococcus) N−ớc thịt 37o C/24h
Thạch máu giữ giống
Kháng sinh đồ