Pheromone giới tính - Khảo sát hiệu lực của nấm xa- 123docz.net

Pheromone giới tính (sex pheromone) là hóa chất tín hiệu được tiết ra ngoài môi trường để hấp dẫn sự bắt cặp của những cá thể khác giới trong cùng một loài. Có thể do thành trùng đực hay cái tiết ra, thông thường là do thành trùng cái tiết ra (Lê Văn Vàng, 2006).

Do hoạt động như những hóa chất sinh học với tính chọn lọc cao và ở nồng độ rất thấp nên pheromone giới tính không gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Pheromone giới tính là một sự thay thế hiệu quả cho nông dược trong công tác quản lý sâu hại (Gibb et al., 2005; trích dẫn Huỳnh Thị Ngọc Linh, 2010).

2 Chương 2

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện: từ tháng 2 năm 2012 đến tháng 12 năm 2012.

Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.

2.1.2 Vật liệu và dụng cụ a. Dụng cụ a. Dụng cụ

- Hộp nhựa các loại, mụn sơ dừa. - Vải lượt, giấy thấm, bông gòn. - Kẹp gắp côn trùng.

- Micro syringe, máy phun thuốc và một số dụng cụ cần thiết khác.

b. Vật liệu

Khoai lang

Khoai lang sử dụng trong quá trình thí nghiệm được mua tại các vựa khoai lang ở xã Thuận An, huyện Bình Minh. Chọn những củ khoai tốt, không bị nhiễm sùng để sử dụng trong các thí nghiệm

Sùng khoai lang

Thu củ khoai lang bị sùng tấn công tại các ruộng khoai ở huyện Bình Tân - Vĩnh Long về bảo quản trong rổ nhựa tại phòng thí nghiệm. Khi sùng đã vũ hóa và thoát ra bên ngoài, tách riêng sùng đực - cái để sử dụng cho các thí nghiệm. Thành trùng sùng khoai lang được nuôi trong hộp nhựa đậy kín bằng vải thoáng khí, bên trong có củ khoai lang sạch làm thức ăn. Đồng thời, rổ khoai cũng được dùng để hấp dẫn thành trùng sùng khoai lang đực thực hiện ở thí nghiệm 3 (khảo sát khả năng lây lan của nấm xanh Ma trong quần thể thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) trong điều kiện phòng thí nghiệm).

Hình 2.1 Rổ khoai lang đã nhiễm sùng

Nguồn nấm ký sinh

a) Nấm xanh (Ma) b) Nấm trắng (Bb) c) Nấm tím (Pae) Hình 2.2 Ba loại nấm ký sinh

- Dung dịch nấm Metarhizium anisopliae (Ma), nấm Beauveria bassiana

(Bb), nấm Paecilomyces sp. (Pae)

Dung dịch bào tử nấm xanh (Ma), nấm trắng (Bb) và nấm tím (Pae) được lấy trực tiếp từ đĩa petri. Các đĩa nấm sau khi cấy khoảng 2 tuần, quan sát thấy bào tử đã mọc đều khắp đĩa và không bị nhiễm tạp thì có thể sử dụng trong thí nghiệm. Thu hết bào tử nấm bằng nước cất đã thanh trùng. Lọc lấy dung dịch bào tử nấm bằng 3 lớp lưới mịn. Xác định mật số bào tử bằng lame đếm Thoma. Mật số bào tử được tính bằng công thức như sau:

Số bào tử = 4 x a x b x 106 (bào tử/ml) Trong đó:

a: số bào tử trung bình/ô nhỏ nhất b: hệ số pha loãng

- Chế phẩm nấm xanh

Sử dụng chế phẩm nấm xanh Ma do phòng thí nghiệm Nedo, bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ cung cấp. Chế phẩm nấm xanh Ma có 2 dạng: dạng nấm tươi và dạng bột khô.

Cách làm nấm tươi trong điều kiện phòng thí nghiệm:

Nguyên vật liệu: gạo trắng (0,5kg/bọc), đĩa nấm nguồn Ma, bọc nilon 20x30 cm, nút bông gòn không thấm nước, giấy báo, dây thun và một số dụng cụ cần thiết khác.

Chuẩn bị: ngâm gạo trong nước sạch 1 giờ trước khi vo sạch và để ráo nước. Sau đó cho vào các túi nilon kích thước 20x30 cm (0,5 kg gạo/bọc), buộc kín và thanh trùng bằng Autoclave ở 1210C trong 30 phút, để nguội.

Cách làm: cắt 1/4 đĩa nấm nguồn Ma ra thành nhiều mảnh nhỏ (khoảng 0,5 cm2) cho vào bọc gạo đã chuẩn bị, phía trên để nút bông gòn và buộc lại bằng giấy báo. Đem ủ bọc gạo trong điều kiện nhiệt độ từ 28-300C, thoáng mát và tránh ánh nắng trực tiếp. Để yên bọc chế phẩm trong 3 ngày đầu, từ ngày thứ 4 trở đi lắc bọc chế phẩm 1 lần/ngày để bào tử nấm phát triển đều khắp môi trường xốp bên trong bọc gạo.

Sau 10-14 ngày nuôi cấy mật số bào tử có thể đạt được 108-109 bào tử/g sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm.

a) Dạng tươi b) Dạng bột khô

Pheromone giới tính tổng hợp

Pheromone giới tính của sùng khoai lang là hợp chất (Z)-3-Dodecenyl-(E)- 2-Butenoate (Z3-12:E2) được pha loãng trong n-hexane tinh khiết với tỉ lệ 1mg/10μl. Dùng micro syringe dung tích 25 μl hút 3μldung dịch tổng hợp được cho vào ống cao su non. Sau khi dung môi bay hơi, ống cao su non trên không thêm vào bất cứ một chất nào khác được gói lại bằng giấy nhôm, hàn kín, dán nhãn và bảo quản ở 0oC cho đến khi sử dụng.

Hình 2.4 Pheromone giới tính tổng hợp 2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Thí nghiệm 1: khảo sát hiệu lực của nấm xanh Ma, nấm trắng Bb

và nấm tím Pae đối với thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius

Fabricius) trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu: xác định chủng nấm có hiệu lực cao đối với thành trùng sùng khoai lang trong điều kiện phòng thí nghiệm làm cơ sở ứng dụng phòng trị sùng khoai lang ở điều kiện ngoài đồng.

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lặp lại quan sát 30 cá thể thành trùng và 4 nghiệm thức như sau:

Nghiệm thức Thành phần

A Dung nấm trắng Bb (108 bào tử/ml) B Dung dịch nấm tím Pae (108 bào tử/ml) C Dung dịch nấm xanh Ma (108 bào tử/ml)

Cách tiến hành: cho khoảng 50 thành trùng sùng khoai lang vào đĩa petri có chứa 10ml dung dịch nấm trắng Bb, sau 20 giây tiến hành vớt sùng ra chọn 30 cá thể khỏe bò ra ngoài cho vào 30 hộp nhựa nhỏ. Mỗi hộp sẽ bao gồm một mẫu giấy thấm nước để giữ ẩm, một miếng khoai lang nhỏ để làm thức ăn và một thành trùng sùng khoai lang đã được chủng nấm. Thực hiện tương tự đối với các nghiệm thức khác (đối chứng thay bằng nước cất).

Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm 1

Cách lấy chỉ tiêu: theo dõi và ghi nhận tỉ lệ sùng chết vào các ngày 3, 5, 7, 9, 11, 13, và 15 sau khi chủng nấm. Nhiệt độ, ẩm độ trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm.

Hiệu lực của nấm ký sinh được tính theo công thức Abbott dựa vào tỉ lệ sùng chết. Độ hữu hiệu (%) = C T C x 100

Trong đó: C: tỷ lệ (%) thành trùng SKL sống ở nghiệm thức đối chứng T: tỷ lệ (%) thành trùng SKL sống ở nghiệm thức có xử lý nấm Xử lý số liệu: số liệu ghi nhận được nhập vào phần mềm Excel để tính độ hữu hiệu, sau đó phân tích thống kê bằng chương trình MSTATC.

2.2.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của mật số bào tử nấm xanh Ma

lên hiệu quả gây chết thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius)

trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu: xác định nồng độ bào tử nấm xanh Ma cho hiệu quả gây chết thành trùng sùng khoai lang cao nhất.

Khảo sát hiệu quả của nấm xanh Ma ở các nồng độ khác nhau gồm 5 nghiệm thức được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại quan sát 30 cá thể.

Nghiệm thức Thành phần

A Dung dịch nấm xanh Ma 106 (bào tử/ml) B Dung dịch nấm xanh Ma 107 (bào tử/ml) C Dung dịch nấm xanh Ma 108 (bào tử/ml) D Dung dịch nấm xanh Ma 109 (bào tử/ml)

ĐC Nước cất thanh trùng

Cách tiến hành tương tự thí nghiệm 1.

Hiệu lực của nấm ký sinh được tính theo công thức Abbott dựa vào tỉ lệ sùng chết.

2.2.3 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của các chủng nấm xanh Ma

lên hiệu quả gây chết thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu: xác định chủng nấm xanh Ma cho hiệu quả gây chết thành trùng sùng khoai lang cao nhất trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Khảo sát hiệu quả của các chủng nấm xanh Ma gồm 4 nghiệm thức được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại quan sát 30 cá thể.

Nghiệm thức Thành phần

A Ma phân lập từ sùng khoai lang (108 bào tử/ml) B Ma phân lập từ bọ xít nhãn (108 bào tử/ml) C Ma phân lập từ bọ dừa (108 bào tử/ml)

ĐC Nước cất thanh trùng

Cách lấy chỉ tiêu: theo dõi và ghi nhận tỉ lệ sùng chết vào các ngày 3, 5, 7, 9, 11 và 13 ngày sau khi chủng nấm. Nhiệt độ, ẩm độ trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.

Hiệu lực của nấm ký sinh được tính theo công thức Abbott dựa vào tỉ lệ sùng chết.

2.2.4 Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng lây lan của các dạng nấm xanh

Ma trong quần thể thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius)

trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu: thí nghiệm được thực hiện nhằm khảo sát hiệu quả và khả năng lây lan của thành trùng sùng đực bị nhiễm nấm xanh Ma ở những dạng khác nhau được hấp dẫn bởi pheromone giới tính.

Khảo sát khả năng lây lan của các dạng nấm xanh Ma trong quần thể sùng khoai lang được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

Nghiệm thức Thành phần

A Pheromone + Dạng dd từ đĩa petri (108 bào tử/ml) B Pheromone + Dạng nấm tươi

C Pheromone + Dạng bột khô

ĐC Pheromone + Nước cất thanh trùng

Mỗi lần lặp lại gồm 5 thành trùng sùng khoai lang đực đã tiếp xúc với pheromone và nhiễm nấm xanh ở các dạng khác nhau (đối chứng dùng nước cất) và 150 thành trùng khỏe chia đều vào 5 hộp nhựa (15x15x24 cm). Như vậy, mỗi hộp nhựa bao gồm 1 sùng khoai lang đực đã tiếp xúc với pheromone, nhiễm nấm xanh Ma và 30 thành trùng sùng khỏe mạnh chưa nhiễm nấm thoát ra từ củ khoai.

Cách tiến hành: tiến hành hấp dẫn sùng khoai lang đực và lây nhiễm nấm bằng cách thực hiện bẫy như sau:

Hình 2.6 Bẫy pheromone giới tính tổng hợp hấp dẫn SKL và lây nhiễm nấm xanh Ma

Hộp nhựa (12x12x18 cm) được cắt 3 cửa bẫy xung quanh hộp như hình trên, phần đáy hộp để dung dịch nấm xanh, nấm tươi, nấm bột xanh hoặc nước cất tùy từng nghiệm thức. Để bẫy gần rổ khoai lang nuôi sùng, đợi sùng bay vào tiếp xúc với pheromone và rơi xuống đáy hộp, sau đó bò ra bên ngoài bẫy thì dùng kẹp gắp vào hộp nhựa đã chuẩn bị trước gồm 30 thành trùng sùng khoai lang khỏe mạnh không bị nhiễm nấm, 1 củ khoai. Bên dưới đáy hộp rãi một lớp mụn sơ dừa thanh trùng bằng Autoclave ở 121oC trong 30 phút để giữ ẩm và tạo môi trường tương tự như trong tự nhiên.

Cách lấy chỉ tiêu: theo dõi và đánh giá khả năng lây lan của các dạng nấm xanh thể hiện qua tỉ lệ sùng chết theo thời gian. Ghi nhận chỉ tiêu vào các ngày: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 và 36 sau khi thả sùng đực vào. Nhiệt độ và ẩm độ trong quá trình thực hiện thí nghiệm.

2.2.5 Thí nghiệm 5: khảo sát khả năng ký sinh của nấm xanh Ma trong quần thể thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) qua các hình quần thể thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) qua các hình thức xử lý khác nhau trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu: nhằm khảo sát hiệu quả và khả năng ký sinh gây chết thành trùng sùng khoai lang của nấm xanh Ma ở những dạng khác nhau.

Khảo sát khả năng ký sinh của nấm xanh Ma trong quần thể sùng khoai lang được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

Nghiệm thức Thành phần

A Dạng nấm tươi + rãi (2g/hộp)

B Dạng nấm tươi hòa vào nước + phun (10

bào tử/ml, phun 20 giây, tương đương 5ml)

C Dạng bột khô + rãi (1g/hộp)

D Dạng bột khô hòa vào nước + phun (10

bào tử/ml phun 20 giây, tương đương 5ml)

ĐC Nước cất thanh trùng + phun

Cách tiến hành: tùy theo từng nghiệm thức mà tiến hành rãi hoặc phun các dạng nấm khác nhau vào lớp mụn sơ dừa đã thanh trùng bằng Autoclave ở 121oC trong 30 phút được nén chặt trong đáy hộp nhựa kích thước (15x15x24 cm) nhằm giữ ẩm và tạo môi trường tương tự trong tự nhiên, bên trên để một miếng khoai lang làm thức ăn. Sau đó cho vào hộp 30 con sùng khỏe mạnh không bị nhiễm nấm thoát ra từ củ khoai.

Cách lấy chỉ tiêu: theo dõi và đánh giá khả năng ký sinh của các dạng nấm xanh Ma thể hiện qua tỉ lệ sùng chết do bị nhiễm nấm xanh Ma theo thời gian. Ghi nhận chỉ tiêu vào các ngày: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 và 24 sau khi xử lý nấm. Nhiệt độ và ẩm độ trong quá trình thực hiện thí nghiệm.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hiệu lực của nấm xanh Ma, nấm trắng Bb và nấm tím Pae đối với thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) trong điều kiện thành trùng sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Bảng 3.1 Độ hữu hiệu của nấm xanh Ma, nấm trắng Bb, nấm tím Pae trong điều kiện phòng thí nghiệm qua các thời điểm.

T: 31,3oC RH: 67,1%

Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) vào các ngày sau khi chủng (NSKC)

3 5 7 9 11 13 15 Nấm xanh Ma 43,42 a 92,68 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a Nấm trắng Bb 25,33 b 79,35 b 97,53 a 100 a 100 a 100 a 100 a Nấm tím Pae 21,71 b 25,33 c 27,23 b 27,23 b 27,59 b 27,59 b 31,39 b Đối chứng 0 c 0 d 0 c 0 c 0 c 0 c 0 c CV (%) 11,03 7,55 9,58 3,63 3,63 3,63 5,65 Mức ý nghĩa ** ** ** ** ** ** ** Trong cùng một cột, các trung bình có cùng mẫu tự theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% qua phép thử DUNCAN

Hiệu lực gây chết thành trùng sùng khoai lang (SKL) của nấm xanh Ma, nấm trắng Bb, nấm tím Pae được thể hiện ở bảng 3.1. Kết quả cho thấy cả ba loại nấm đều có khả năng gây chết thành trùng SKL trong điều kiện phòng thí nghiệm ngay từ thời điểm 3 NSKC.

Ở thời điểm 3 NSKC, hiệu lực gây chết thành trùng SKL ở nghiệm thức nấm xanh Ma cao nhất (43,42%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê với 2 nghiệm thức nấm trắng Bb và nấm tím Pae ở mức ý nghĩa 1%.

Ở thời điểm 5 NSKC, tỉ lệ thành trùng SKL chết ở nghiệm thức nấm trắng

Bb và nấm tím Pae tăng rất nhanh. Nghiệm thức nấm xanh Ma có hiệu lực gây chết thành trùng SKL cao nhất (92,68 %) và nghiệm thức nấm tím Pae có hiệu lực thấp nhất (25,3%). Tại thời điểm này, cả 3 nghiệm thức đều hoàn toàn khác biệt với nhau và khác biệt với nghiệm thức đối chứng qua thống kê ở mức ý nghĩa 1%.

Ở thời điểm 7 NSKC, nghiệm thức nấm xanh Ma vẫn cho hiệu lực gây chết thành trùng SKL cao nhất (100%) và nghiệm thức nấm tím Pae cho hiệu lực thấp nhất (27,23%). Tuy nhiên khác với thời điểm 3 NSKC, tại thời điểm này nghiệm thức nấm xanh Ma và nghiệm thức nấm trắng Bb không khác biệt nhau và khác biệt với nghiệm thức nấm tím Pae qua thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Từ thời điểm 5 NSKC trở về sau, tỉ lệ thành trùng SKL chết ở nghiệm thức nấm trắng Bb, nấm tím Pae tiếp tục tăng nhưng nhìn chung hiệu lực gây chết thành trùng SKL ở nghiệm thức nấm tím Pae vẫn thấp nhất (độ hữu hiệu ở thời điểm 15 NSKC là 31,39%). Nghiệm thức nấm trắng Bb đạt độ hữu hiệu 100% ở 9 NSKC.

a) SKL bị nhiễm nấm xanh b) SKL bị nhiễm nấm trắng Hình 3.1 Sùng khoai lang bị nấm xanh, nấm trắng ký sinh

Nhìn chung, cả 3 loại nấm đều có tác dụng gây chết thành trùng SKL trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nấm trắng Bb và nấm tím Pae chỉ có tác dụng rõ rệt sau 5 ngày chủng nấm, riêng đối với nấm tím Pae ở thời điểm 15