Từ 5 mẫu nem chua thu thập tại Cần Thơ, vi khuẩn acid lactic được phân lập trên môi trường MRS agar. Cấy chuyển nhiều lần đến khi khuẩn lạc đặc trưng được tách ròng. Sau khi tiến hành phân lập, 19 dòng vi khuẩn acid lactic đã được tách ròng.
Nguồn mẫu và ký hiệu của 19 dòng vi khuẩn acid lactic được trình bày trong Bảng 9.
Bảng 9: Nguồn mẫu và ký hiệu các dòng vi khuẩn acid lactic được phân lập
STT Nguồn Số dòng VK Tên dòng VK
1 Nem Tư Kiên – Lai Vung 4 V11B, V13A, V21B, V31B
2 Nem Thu Oanh – Cái Răng 3 O22A, O32A, O33A
3 Nem Cô Phúc – Cái Răng 4 P21B, P31B, P32B, P41A
4 Nem Trang – Cái Răng 5 R11B, R13A, R14B, R22B, R33B
5 Nem chợ Xuân Khánh 3 K21A, K32A, K34B
Như vậy ở mỗi nguồn phân lập được 3 đến 5 dòng vi khuẩn. Nguyên tắc đặt tên dòng vi khuẩn là chữ cái đầu tiên được lấy từ tên nguồn, hai chữ số thể hiện số thứ tự của mẫu, chữ cái cuối để phân biệt giữa hai mẫu cùng tên, cùng thứ tự, đồng thời phân biệt với tên của các dòng nấm mốc được phân lập trong cùng đề tài này (tên dòng nấm mốc chỉ gồm 3 ký tự đầu).
Các dòng vi khuẩn được xác định là thuần khi đạt sự đồng nhất về hình thái khuẩn lạc trên đĩa môi trường nuôi cấy, như hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước. Bên cạnh đó, sự đồng nhất về hình thái tế bào khi quan sát dưới kính hiển vi cũng phải được xác định. Dù các loài vi khuẩn acid lactic rất đa dạng về hình dáng như hình que ngắn, que cong, que dài, cầu đơn, cầu đôi, cầu chuỗi, … nhưng sự đồng nhất về hình thái tế bào vẫn là nguyên tắc xác định độ ròng của từng loài.
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 19 dòng vi khuẩn acid lactic được đưa ra trong Bảng 10 và Phụ lục 4 là những hình ảnh cụ thể về khuẩn lạc, tế bào quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần.
Bảng 10: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic phân lập
STT Dòng VK
Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái tế
bào Màu sắc Hình dạng Bìa Độ nổi KT
1 V11B Trắng sữa Tròn Nguyên Mô Nhỏ Cầu đôi
2 V13A Trắng đục Tròn Nguyên Mô Vừa Que ngắn
3 V21B Trắng sữa Tròn Nguyên Lài Nhỏ Cầu đôi
4 V31B Trắng đục Tròn Nguyên Mô Vừa Cầu đôi
5 O22A Trắng sữa Tròn Nguyên Mô Vừa Que ngắn
6 O32A Trắng sữa Tròn Nguyên Lài Nhỏ Cầu đôi
7 O33A Trắng sữa Tròn Nguyên Mô Nhỏ Cầu đôi
8 P21B Trắng sữa Tròn Nguyên Mô Vừa Que ngắn
9 P31B Trắng đục Tròn Nguyên Mô Nhỏ Cầu đôi
10 P32B Trắng đục Tròn Nguyên Mô Vừa Que ngắn
11 P41A Trắng đục Tròn Nguyên Mô Vừa Cầu đôi
12 R11B Trắng đục Tròn Nguyên Mô Vừa Cầu đôi
13 R13A Trắng sữa Tròn Nguyên Mô Vừa Que ngắn
14 R14B Trắng đục Tròn Nguyên Lài Vừa Que ngắn
15 R22B Trắng sữa Tròn Thùy Lài Lớn Que ngắn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
16 R33B Trắng sữa Tròn Nguyên Mô Nhỏ Cầu đôi
17 K21A Trắng sữa Tròn Nguyên Lài Lớn Que ngắn
18 K32A Trắng đục Tròn Nguyên Mô Vừa Que ngắn
19 K34B Trắng sữa Tròn Nguyên Mô Vừa Que ngắn
Ghi chú: KT- Kích thước: (lớn) >2 mm, (vừa) 2-1 mm, (nhỏ) <1 mm.
Tất cả các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc hình tròn, bìa nguyên hoặc chia thùy, màu trắng sữa hoặc trắng đục (Hình 9). Có 5 dòng vi khuẩn có độ nổi lài (25% trên tổng số), còn đa số có độ mô. Có 11 dòng vi khuẩn có kích thước khuẩn lạc vừa (2-1 mm đường kính) chiếm khoảng 58%, 6 dòng trong 19 dòng có khuẩn lạc nhỏ (>1 mm đường kính), chỉ có 2 dòng vi khuẩn có đường kính lớn hơn 2 mm. Về hình thái tế bào quan sát được dưới kính hiển vi thì 10 dòng có tế bào hình que ngắn (53% trên tổng số), còn lại 9 dòng vi khuẩn có dạng hình cầu đôi (Hình 10). Mặc dù hình dạng của các dòng vi khuẩn acid lactic có thể giống nhau nhưng kích thước tế bào của từng dòng
vẫn có khác biệt. Những sự khác biệt trên thể hiện sự đa dạng của loài vi khuẩn acid lactic trong tự nhiên.
Hình 9: Các dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn acid lactic phân lập
Ghi chú: (a): K21A, trắng sữa, kích thước khuẩn lạc lớn; (b): P41A, trắng đục, kích thước khuẩn lạc vừa; (c): O32A, trắng sữa, kích thước khuẩn lạc nhỏ.
Hình 10: Hình dạng tế bào vi khuẩn acid lactic ở độ phóng đại 1000 lần
Ghi chú: (a): O22A, hình que ngắn; (b): V21B, hình cầu đôi.
Các dòng vi khuẩn được tiến hành nhuộm Gram với thuốc nhuộm violet – iod và fushin. Các dòng vi khuẩn được phân lập bắt màu xanh đen của violet – iod nên được kết luận là vi khuẩn Gram dương (Hình 11).
Hình 11: Kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn acid lactic được phân lập
Thử nghiệm catalase với thuốc thử H2O2 của các dòng vi khuẩn được thực hiện và những dòng cho kết quả âm tính sẽ được chọn làm thử nghiệm tiếp theo, tức là không có hiện tượng sủi bọt khí. Điều này chứng tỏ dòng vi khuẩn đó không có enzyme catalase phân giải H2O2 để tạo thành nước và khí oxy (Hình 12). Kết quả này phù hợp với đặc tính của vi khuẩn acid lactic.
Hình 12: Thử nghiệm catalase trên mẫu vi khuẩn
Ghi chú: (a): Dương tính, sủi bọt, R22A; (b): Âm tính, không sủi bọt, V11B.
Thử nghiệm oxydase được thực hiện và cho kết quả âm tính nếu không làm giấy lọc đổi từ màu trắng sang màu xanh dương. Hầu hết các dòng vi khuẩn đều cho kết quả âm tính. Như vậy những dòng vi khuẩn này đều không sinh ra cytochrome oxydase khi được tiếp xúc với giấy lọc có chứa Tetramethyl-p-phenylenediamine và không có màu xanh dương xuất hiện trên giấy lọc (Hình 13). Kết quả này phù hợp với đặc tính của vi khuẩn acid lactic.
Hình 13: Thử nghiện oxydase trên mẫu vi khuẩn
Ghi chú: (a): Dương tính, xanh dương, R22A; (b): Âm tính, trắng, V11B.
Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng phân giải CaCO3 nhờ sự hình thành của acid. Kết quả dương tính được thể hiện qua sự hình thành vùng sáng xung quanh khuẩn lạc trên đĩa môi trường MRS đã bổ sung CaCO3 với nồng độ 1,5% (Hình 14). Kết quả này đúng với đặc tính vi khuẩn acid lactic.
Hình 14: Khả năng phân giải CaCO3 của dòng vi khuẩn R13A
Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên các dòng vi khuẩn acid lactic được tóm tắt trong Bảng 11.
Bảng 11: Đặc điểm sinh hóa và tế bào của các dòng vi khuẩn acid lactic
STT Dòng VK Hình dạng tế bào Gram Oxidase Catalase Phân giải CaCO3 1 V11B Cầu đôi + - - + 2 V13A Que ngắn + - - + 3 V21B Cầu đôi + - - + 4 V31B Cầu đôi + - - + 5 O22A Que ngắn + - - +
6 O32A Cầu đôi + - - +
7 O33A Cầu đôi + - - +
8 P21B Que ngắn + - - +
9 P31B Cầu đôi + - - +
10 P32B Que ngắn + - - +
11 P41A Cầu đôi + - - + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12 R11B Cầu đôi + - - + 13 R13A Que ngắn + - - + 14 R14B Que ngắn + - - + 15 R22B Que ngắn + - - + 16 R33B Cầu đôi + - - + 17 K21A Que ngắn + - - + 18 K32A Que ngắn + - - + 19 K34B Que ngắn + - - +
Kết quả tổng hợp từ Bảng 10 và 11 cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập có đặc điểm khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng đục hoặc trắng sữa, nhô cao hoặc thấp, bìa nguyên hoặc chia thùy, tế bào hình que ngắn hoặc hình cầu đôi, tạo mùi chua của acid, là vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính, có thể phân giải CaCO3. Những đặc điểm này phù hợp với miêu tả của Kandler và Weiss (1986) về vi khuẩn acid lactic. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Hồ Thị Nguyệt Thu (2007) khi thu được các đặc tính tương tự của các dòng vi khuẩn acid lactic được phân lập từ nem chua.