nấm được phân lập
a. Mục đích: Khảo sát và đánh giá khả năng kháng nấm của các dòng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua.
b. Phương pháp:
* Chuẩn bị dịch chủng nấm mốc
Các dòng thuần nấm mốc được cấy chuyển sang đĩa môi trường malt extract agar để tăng sinh ở nhiệt độ 25o
C trong 5 - 7 ngày. Tiến hành thu bào tử nấm mốc bằng dung dịch peptone tiệt trùng 0,2 % w/v. Cho dung dịch peptone vào đĩa tăng sinh nấm mốc, lắc đĩa để dung dịch peptone tràn khắp đĩa và lấy đi các bào tử nấm mốc. Thu dung dịch peptone này và thực hiện thao tác đếm mật số bào tử theo phương pháp đếm hồng cầu dưới kính hiển vi.
Điều chỉnh mật số bào tử nấm mốc về 105
bào tử/mL peptone water.
* Phương pháp kiểm tra khả năng kháng nấm mốc
Thực hiện theo phương pháp dual culture overlay assay (Mayr-Harting et al., 1972).
Vi khuẩn acid lactic sau khi được phân lập thuần được cấy lên đĩa petri môi trường thạch MRS thành 2 đường thẳng, mỗi đường dài 2 cm. Ủ ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ dưới điều kiện kỵ khí.
Nấm mốc sau khi được điều chỉnh về mật số thống nhất trong dung dịch peptone sẽ được chủng sang môi trường mới. Dịch chủng nấm được cho vào môi trường malt extract agar mềm (0,05% malt extract, 1% agar) được khử trùng và làm nguội với tỉ lệ 1 mL dịch chủng nấm với 10 mL môi trường. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Các đĩa vi khuẩn acid lactic sau khi ủ sẽ xuất hiện 2 đường được hình thành từ các khuẩn lạc. Tiến hành đổ chồng lên đĩa 10 mL môi trường malt extract agar mềm đã được chủng nấm. Ủ các đĩa này ở 30o
C trong 48 giờ dưới điều kiện hiếu khí. Sau đó đo vùng kháng nấm.
Đo vùng kháng nấm bên đường cấy vi khuẩn ở ba vị trí: đầu, giữa và cuối đường cấy, sau đó lấy kết quả trung bình cộng.
Sau khi so sánh kết quả, 1 đến 3 dòng vi khuẩn acid lactic có khả năng kháng nấm tốt sẽ được chọn để định danh đến cấp độ loài theo phương pháp sinh học phân tử.