a. Mục đích: Khảo sát và đánh giá mật số tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc trong các mẫu nem chua.
b. Phương pháp:
* Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí (ISO 4833:2003)
Lấy 10 g mẫu cho vào bọc vô trùng chứa 90 mL SPW để đồng hóa trong 30 giây. Như vậy mẫu được xem như đã pha loãng 10 lần. Tiếp tục tiến hành pha loãng lần lượt ở các nồng độ 104
, 105, 106 lần bằng SPW.
Ở mỗi độ pha loãng, rút 1 mL mẫu cho vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ 12-15 mL môi trường PCA đã được làm nguội đến 47oC vào mỗi đĩa petri. Trộn đều môi trường với dịch mẫu bằng cách lắc đều theo hình số 8, để yên đợi môi trường đông lại.
Lật ngược đĩa và tiến hành ủ ở 30oC trong thời gian 72 giờ. Sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa và tính toán kết quả.
Nếu có thể đếm những đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250.
Khuẩn lạc mọc lan có thể tính như là một khuẩn lạc nếu số khuẩn mọc lan nhỏ hơn ¼ đĩa, nếu lớn hơn thì không đọc kết quả trên đĩa này.
Số lượng N vi khuẩn có trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
d n n V C N ) 1 , 0 ( 1 2 Trong đó:
C là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở 2 độ pha loãng kế tiếp nếu các đĩa đều có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250
V là thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (mL) n1 là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất
n2 là số đĩa ở độ pha loãng thứ hai
d là nồng độ tương ứng đối với độ pha loãng thứ nhất.
Báo cáo kết quả vi sinh vật hiếu khí trên 1 g mẫu hay trên 1 mL mẫu bằng cách sử dụng hai chữ số có nghĩa (ví dụ 7,4.104
CFU/g).
Nếu không có khuẩn lạc phát triển ở độ pha lãng 10-1
, báo cáo kết quả <10 CFU/g.
* Định lượng vi khuẩn acid lactic (ISO 15214:1998)
Đồng hóa 10 g mẫu với 90 mL SPW bằng máy dập mẫu trong 30 giây. Chuyển 1 mL dung dịch mẫu vào đĩa petri vô trùng, thao tác này được lặp lại trên 2 đĩa.
Tiến hành tương tự cho những độ pha loãng tiếp theo 10-4, 105, 106.
Đổ vào mỗi đĩa khoảng 15 mL môi trường MRS đã được chuẩn bị làm nguội đến 47oC trong bể điều nhiệt (water bath). Cẩn thận trộn đều môi trường với dịch mẫu bằng cách lắc nhẹ đĩa theo hình số 8. Lật ngược đĩa và đem ủ ở 30oC trong 72 giờ.
Sau khi ủ, tiến hành đếm khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa và tính toán kết quả. Đếm trên các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15 - 300 khuẩn lạc ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp nhau.
Số lượng vi khuẩn acid lactic trong mẫu được xác định theo phương trình sau:
d n n V C N ) 1 , 0 ( 1 2
* Định lượng nấm mốc (3113 /1999/QĐ-BYT)
Dung dịch pha loãng được dùng là nước peptone tiệt trùng 0,2% w/v (hoặc SPW). Cho 10 g mẫu với 90 mL dung dịch pha loãng vào bọc vô trùng, rồi đồng hóa mẫu trong 30 giây.
Chuẩn bị môi trường SDA, khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó làm nguội môi trường trong bể điều nhiệt tới nhiệt độ 45oC, chỉnh về pH 3,5 bằng cách thêm 1 mL lactic acid 10% vào mỗi 100 mL môi trường.
Cho 1 mL dịch mẫu pha loãng vào mỗi đĩa petri vô trùng. Chủng mẫu theo phương pháp đổ đĩa tương tự như cách định lượng cho vi sinh vật hiếu khí. Đổ tiếp vào mỗi đĩa khoảng 15 mL môi trường SDA được khử trùng và làm nguội đến 45oC. Lắc trộn đều dịch mẫu và môi trường, sau đó để yên cho môi trường đông đặc. Mỗi độ pha loãng được thực hiện trên 3 đĩa, có thể chia trực tiếp 3 mL dịch mẫu lên 2 đĩa môi trường.
Làm tương tự các bước trên cho các độ pha loãng 10-4, 105, 106 . Lật ngược đĩa và đem ủ ở nhiệt độ 30oC trong vòng 5 ngày.
Tiến hành đếm khuẩn lạc liên tục trong khoảng thời gian từ 1 - 5 ngày. Nếu nấm mốc phát triển quá mạnh, các khuẩn lạc hình thành không rời rạc khi chưa kết thúc 5 ngày, ta có thể lấy kết quả trong các ngày trước đó.
Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15 - 150 để tính kết quả. Số lượng nấm mốc trong mẫu được xác định theo công thức:
d n n V C N ) 1 , 0 ( 1 2
3.2.4. Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn acid lactic từ nem chua
a. Mục đích: Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn lactic thuần chủng.
b. Phương pháp:
Nem chua sau khi được đem về sẽ được loại bỏ hết phần vỏ lá và vỏ nilon bao bên ngoài. Mẫu được đồng hóa với nước peptone tiệt trùng 0,2% w/v theo tỷ lệ 10 g mẫu với 90 mL nước peptone. Dùng micropipette rút 2 mL dung dịch đồng hóa cho vào bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường MRS broth, ủ kỵ khí ở 37oC trong 48 giờ.
Sau khi ủ, rút 1 mL dung dịch mẫu tiến hành trãi lên đĩa petri chứa môi trường thạch MRS. Các đĩa được lật ngược và ủ ở nhiệt độ 37oC. Sau 48 giờ, quan sát và chọn
những khuẩn lạc tiêu biểu tiến hành cấy chuyển vi khuẩn theo hình zigzac sang đĩa môi trường MRS agar. Quá trình cấy chuyển trên đĩa môi trường thạch được lặp lại nhiều lần cho đến độ thuần vi khuẩn được xác định.
Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn lactic. Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, trắng trong, bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy. Khuẩn lạc này nằm trên đường cấy chuyển và không lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ.
Sau khi được tách ròng, những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học. Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất vô trùng, đặt trên miếng lame đã khử trùng bằng cồn 96% thực hiện quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở vật kính 40X và 100X.
Tiến hành nhuộm Gram, thử catalase, thử oxydase, nhuộm bào tử và kiểm tra khả năng phân giải CaCO3.
Vi khuẩn acid lactic được xác định khi những dòng phân lập có hình tròn hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính và phân giải được CaCO3.