Hình 5: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 3.2.1. Thu thập mẫu
Năm mẫu nem chua được thu thập từ chợ Xuân Khánh và các cơ sở sản xuất nem chua ở Cái Răng, bến xe Cần Thơ. Mẫu sẽ được dùng để đánh giá cảm quan, phân tích lượng acid, chỉ số pH, phân lập vi khuẩn acid lactic và nấm mốc và mẫu sẽ được thu với trạng thái đồng đều từ các nguồn.
Tất cả mẫu thu về sẽ được mã hóa thành tên dòng vi sinh vật được phân lập.
3.2.2. Phân tích chỉ tiêu cảm quan, chỉ số pH, định lượng acid lactic
a. Mục đích: Đánh giá chất lượng nem chua với chỉ tiêu cảm quan, chỉ số pH, lượng acid lactic.
Thu thập mẫu
Đánh giá cảm quan, pH, định lượng acid lactic
Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn lactic, nấm mốc
Phân lập vi khuẩn acid lactic Phân lập nấm mốc
Định danh sơ bộ Chuẩn bị dịch chủng nấm
Tuyển chọn vi khuẩn kháng nấm
b. Phương pháp:
Các mẫu nem sẽ được đánh giá cảm quan dựa trên màu sắc, mùi vị theo từng mức độ, và được cho điểm (Phụ lục 2).
Cân 10 g mẫu cho vào bọc vô trùng chứa 90 mL nước peptone tiệt trùng. Đồng hóa mẫu trong 30 giây và để yên ngâm mẫu trong 30 phút. Dung dịch này được xem là pha loãng 10 lần và sẽ được đo chỉ số pH.
* Định lượng acid lactic theo phương pháp xác định độ chua Therner
Phương pháp định lượng acid lactic theo Therner dựa trên nguyên tắc xác định độ chua Therner và tính hàm lượng g acid lactic trong 100 mL (g) mẫu. Độ Therner là số mL dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 100 mL mẫu.
Dùng 20 mL mẫu được đồng hóa, định mức đến 100 mL bằng nước cất, rồi lắc đều. Nhỏ 2 - 3 giọt phenolphtalein 1% vào bình, lắc đều và đem chuẩn độ.
Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt và bền trong vòng 30 giây.
Tính toán kết quả :
X = N x 0,009 x 100/ M Trong đó:
X: lượng acid lactic có trong 100 mL mẫu (g) N: số mL NaOH dùng chuẩn độ
M: khối lượng mẫu (g)
0,009: là lượng acid lactic tương đương với 1 mL NaOH phản ứng
3.2.3. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc a. Mục đích: Khảo sát và đánh giá mật số tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid a. Mục đích: Khảo sát và đánh giá mật số tổng vi sinh vật hiếu khí, vi khuẩn acid lactic và nấm mốc trong các mẫu nem chua.
b. Phương pháp:
* Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí (ISO 4833:2003)
Lấy 10 g mẫu cho vào bọc vô trùng chứa 90 mL SPW để đồng hóa trong 30 giây. Như vậy mẫu được xem như đã pha loãng 10 lần. Tiếp tục tiến hành pha loãng lần lượt ở các nồng độ 104
, 105, 106 lần bằng SPW.
Ở mỗi độ pha loãng, rút 1 mL mẫu cho vào 2 đĩa petri vô trùng. Sau đó đổ 12-15 mL môi trường PCA đã được làm nguội đến 47oC vào mỗi đĩa petri. Trộn đều môi trường với dịch mẫu bằng cách lắc đều theo hình số 8, để yên đợi môi trường đông lại.
Lật ngược đĩa và tiến hành ủ ở 30oC trong thời gian 72 giờ. Sau đó đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa và tính toán kết quả.
Nếu có thể đếm những đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250.
Khuẩn lạc mọc lan có thể tính như là một khuẩn lạc nếu số khuẩn mọc lan nhỏ hơn ¼ đĩa, nếu lớn hơn thì không đọc kết quả trên đĩa này.
Số lượng N vi khuẩn có trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
d n n V C N ) 1 , 0 ( 1 2 Trong đó:
C là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở 2 độ pha loãng kế tiếp nếu các đĩa đều có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250
V là thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (mL) n1 là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất
n2 là số đĩa ở độ pha loãng thứ hai
d là nồng độ tương ứng đối với độ pha loãng thứ nhất.
Báo cáo kết quả vi sinh vật hiếu khí trên 1 g mẫu hay trên 1 mL mẫu bằng cách sử dụng hai chữ số có nghĩa (ví dụ 7,4.104
CFU/g).
Nếu không có khuẩn lạc phát triển ở độ pha lãng 10-1
, báo cáo kết quả <10 CFU/g.
* Định lượng vi khuẩn acid lactic (ISO 15214:1998)
Đồng hóa 10 g mẫu với 90 mL SPW bằng máy dập mẫu trong 30 giây. Chuyển 1 mL dung dịch mẫu vào đĩa petri vô trùng, thao tác này được lặp lại trên 2 đĩa.
Tiến hành tương tự cho những độ pha loãng tiếp theo 10-4, 105, 106.
Đổ vào mỗi đĩa khoảng 15 mL môi trường MRS đã được chuẩn bị làm nguội đến 47oC trong bể điều nhiệt (water bath). Cẩn thận trộn đều môi trường với dịch mẫu bằng cách lắc nhẹ đĩa theo hình số 8. Lật ngược đĩa và đem ủ ở 30oC trong 72 giờ.
Sau khi ủ, tiến hành đếm khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa và tính toán kết quả. Đếm trên các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15 - 300 khuẩn lạc ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp nhau.
Số lượng vi khuẩn acid lactic trong mẫu được xác định theo phương trình sau:
d n n V C N ) 1 , 0 ( 1 2
* Định lượng nấm mốc (3113 /1999/QĐ-BYT)
Dung dịch pha loãng được dùng là nước peptone tiệt trùng 0,2% w/v (hoặc SPW). Cho 10 g mẫu với 90 mL dung dịch pha loãng vào bọc vô trùng, rồi đồng hóa mẫu trong 30 giây.
Chuẩn bị môi trường SDA, khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó làm nguội môi trường trong bể điều nhiệt tới nhiệt độ 45oC, chỉnh về pH 3,5 bằng cách thêm 1 mL lactic acid 10% vào mỗi 100 mL môi trường.
Cho 1 mL dịch mẫu pha loãng vào mỗi đĩa petri vô trùng. Chủng mẫu theo phương pháp đổ đĩa tương tự như cách định lượng cho vi sinh vật hiếu khí. Đổ tiếp vào mỗi đĩa khoảng 15 mL môi trường SDA được khử trùng và làm nguội đến 45oC. Lắc trộn đều dịch mẫu và môi trường, sau đó để yên cho môi trường đông đặc. Mỗi độ pha loãng được thực hiện trên 3 đĩa, có thể chia trực tiếp 3 mL dịch mẫu lên 2 đĩa môi trường.
Làm tương tự các bước trên cho các độ pha loãng 10-4, 105, 106 . Lật ngược đĩa và đem ủ ở nhiệt độ 30oC trong vòng 5 ngày.
Tiến hành đếm khuẩn lạc liên tục trong khoảng thời gian từ 1 - 5 ngày. Nếu nấm mốc phát triển quá mạnh, các khuẩn lạc hình thành không rời rạc khi chưa kết thúc 5 ngày, ta có thể lấy kết quả trong các ngày trước đó.
Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15 - 150 để tính kết quả. Số lượng nấm mốc trong mẫu được xác định theo công thức:
d n n V C N ) 1 , 0 ( 1 2
3.2.4. Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn acid lactic từ nem chua
a. Mục đích: Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn lactic thuần chủng.
b. Phương pháp:
Nem chua sau khi được đem về sẽ được loại bỏ hết phần vỏ lá và vỏ nilon bao bên ngoài. Mẫu được đồng hóa với nước peptone tiệt trùng 0,2% w/v theo tỷ lệ 10 g mẫu với 90 mL nước peptone. Dùng micropipette rút 2 mL dung dịch đồng hóa cho vào bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường MRS broth, ủ kỵ khí ở 37oC trong 48 giờ.
Sau khi ủ, rút 1 mL dung dịch mẫu tiến hành trãi lên đĩa petri chứa môi trường thạch MRS. Các đĩa được lật ngược và ủ ở nhiệt độ 37oC. Sau 48 giờ, quan sát và chọn
những khuẩn lạc tiêu biểu tiến hành cấy chuyển vi khuẩn theo hình zigzac sang đĩa môi trường MRS agar. Quá trình cấy chuyển trên đĩa môi trường thạch được lặp lại nhiều lần cho đến độ thuần vi khuẩn được xác định.
Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn lactic. Những dòng vi khuẩn được chấp nhận khi có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, trắng trong, bờ láng, lồi, bìa nguyên hoặc chia thùy. Khuẩn lạc này nằm trên đường cấy chuyển và không lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc lạ.
Sau khi được tách ròng, những dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học. Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất vô trùng, đặt trên miếng lame đã khử trùng bằng cồn 96% thực hiện quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở vật kính 40X và 100X.
Tiến hành nhuộm Gram, thử catalase, thử oxydase, nhuộm bào tử và kiểm tra khả năng phân giải CaCO3.
Vi khuẩn acid lactic được xác định khi những dòng phân lập có hình tròn hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính, oxydase âm tính và phân giải được CaCO3.
3.2.5. Phân lập nấm mốc từ nem chua
a. Mục đích: Phân lập các dòng nấm mốc thuần chủng.
b. Phương pháp:
Lấy 10 g mẫu cho vào túi vô trùng có chứa 90 mL dung dịch peptone 0,2% w/v. Mẫu được đồng hóa với nước peptone tiệt trùng bằng máy dập mẫu. Môi trường nuôi cấy SDA được chuẩn bị và khử trùng, sau đó cho vào đĩa petri. Rút 1 mL dung dịch đồng hóa cho vào đĩa petri đã chuẩn bị sẵn môi trường và trải ra khắp mặt đĩa. Lật ngược đĩa và ủ ở 25o
C trong 48 - 72 giờ.
Trong quá trình ủ, liên tục quan sát sự xuất hiện của các khuẩn lạc mới xuất hiện. Cấy chuyển các khuẩn lạc đó sang đĩa môi trường thạch SDA mới. Nếu đĩa không có khuẩn lạc mới xuất hiện thêm thì có thể khử bỏ đĩa môi trường đó để tiếp tục cấy chuyển trên các đĩa khác. Quá trình cấy chuyển sẽ được thực hiện lặp lại đến khi đạt được dòng thuần.
Các dòng thuần sẽ được quan sát khẳng định độ thuần dựa vào hình thái khuẩn lạc và quan sát trên kính hiển vi.
Khi các dòng thuần được xác định, sẽ được cấy chuyển vào môi trường SDA thạch nghiêng để trữ cho các thao tác nghiên cứu tiếp theo.
3.2.6. Khảo sát khả năng kháng nấm của vi khuẩn acid lactic với các dòng nấm được phân lập nấm được phân lập
a. Mục đích: Khảo sát và đánh giá khả năng kháng nấm của các dòng vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua.
b. Phương pháp:
* Chuẩn bị dịch chủng nấm mốc
Các dòng thuần nấm mốc được cấy chuyển sang đĩa môi trường malt extract agar để tăng sinh ở nhiệt độ 25o
C trong 5 - 7 ngày. Tiến hành thu bào tử nấm mốc bằng dung dịch peptone tiệt trùng 0,2 % w/v. Cho dung dịch peptone vào đĩa tăng sinh nấm mốc, lắc đĩa để dung dịch peptone tràn khắp đĩa và lấy đi các bào tử nấm mốc. Thu dung dịch peptone này và thực hiện thao tác đếm mật số bào tử theo phương pháp đếm hồng cầu dưới kính hiển vi.
Điều chỉnh mật số bào tử nấm mốc về 105
bào tử/mL peptone water.
* Phương pháp kiểm tra khả năng kháng nấm mốc
Thực hiện theo phương pháp dual culture overlay assay (Mayr-Harting et al., 1972).
Vi khuẩn acid lactic sau khi được phân lập thuần được cấy lên đĩa petri môi trường thạch MRS thành 2 đường thẳng, mỗi đường dài 2 cm. Ủ ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ dưới điều kiện kỵ khí.
Nấm mốc sau khi được điều chỉnh về mật số thống nhất trong dung dịch peptone sẽ được chủng sang môi trường mới. Dịch chủng nấm được cho vào môi trường malt extract agar mềm (0,05% malt extract, 1% agar) được khử trùng và làm nguội với tỉ lệ 1 mL dịch chủng nấm với 10 mL môi trường. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Các đĩa vi khuẩn acid lactic sau khi ủ sẽ xuất hiện 2 đường được hình thành từ các khuẩn lạc. Tiến hành đổ chồng lên đĩa 10 mL môi trường malt extract agar mềm đã được chủng nấm. Ủ các đĩa này ở 30o
C trong 48 giờ dưới điều kiện hiếu khí. Sau đó đo vùng kháng nấm.
Đo vùng kháng nấm bên đường cấy vi khuẩn ở ba vị trí: đầu, giữa và cuối đường cấy, sau đó lấy kết quả trung bình cộng.
Sau khi so sánh kết quả, 1 đến 3 dòng vi khuẩn acid lactic có khả năng kháng nấm tốt sẽ được chọn để định danh đến cấp độ loài theo phương pháp sinh học phân tử.
3.2.7. Định danh cấp độ loài các dòng vi khuẩn được tuyển chọn
a. Mục đích: Xác định tên loài của những dòng vi khuẩn acid lactic có kết quả tốt nhất.
b. Phương pháp: Định danh theo phương pháp sinh học phân tử
Các dòng vi khuẩn acid lactic được giải trình tự nucleotide vùng 16S rDNA. - Ly trích DNA vi khuẩn acid lactic.
- Kiểm tra hàm lượng và chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ và điện di trên gel agarose 0,8%.
- Chạy PCR khuếch đại vùng 16S rDNA với cặp mồi: 1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ - Tinh sạch sản phẩm khuếch đại.
- Kiểm tra hàm lượng và chất lượng sản phẩm sau tinh sạch bằng phương pháp quang phổ và điện di trên gel agarose 2%.
- Giải trình tự sản phẩm PCR bằng máy giải trình tự tự động. - So sánh BLAST trên NCBI để xác định tên dòng vi khuẩn.
3.2.8. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập, xử lý số liệu và phần mềm thống kê Statgraphics XV để phân tích ANOVA và so sánh các giá trị trung bình.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thu thập mẫu
Nem chua được thu thập từ 5 cửa hàng bán lẻ khác nhau tại Cần Thơ với trạng thái ở ngày thứ tư tính theo ngày sản xuất trên bao bì.
- Nem Tư Kiên – Lai Vung - Nem Thu Oanh – Cái Răng - Nem Cô Phúc – Cái Răng - Nem Trang – Cái Răng - Nem chợ Xuân Khánh
Trong đó, ba loại nem từ Cái Răng được cửa hàng bán lẻ lấy hàng trực tiếp từ các cơ sở sản xuất tương ứng tại Quận Cái Răng. Nem chua được mua ở chợ Xuân Khánh là nem chua của chính cửa hàng này sản xuất và mẫu nem chua Tư Kiên – Lai Vung được thu mua từ bến xe Cần Thơ có nguồn gốc từ Đồng Tháp.
4.2. Phân tích chỉ tiêu đánh giá cảm quan, chỉ số pH, định lượng acid lactic 4.2.1. Đánh giá cảm quan 4.2.1. Đánh giá cảm quan
Dựa vào các chỉ tiêu và cách tính điểm cho các mẫu nem chua theo Phụ lục 2, kết quả đánh giá cảm quan trung bình của 3 thành viên được đưa ra trong Bảng 5.
Bảng 5: Kết quả đánh giá cảm quan nem chua
TT Mẫu Màu sắc Mùi Vị Độ dính Nấm mốc Tổng
1 Nem Tư Kiên – Lai Vung 0,67 0,67 2 2 2 7,34
2 Nem Thu Oanh – Cái Răng 2 1,33 2 1,67 2 9,0
3 Nem Cô Phúc – Cái Răng 2 2 2 1,67 2 9,67
4 Nem Trang – Cái Răng 2 2 1,33 2 2 9,33
5 Nem chợ Xuân Khánh 1 1,67 2 0,67 2 7,34
Ghi chú: Các số liệu trong bảng là trung bình của ba lần lặp lại.
Tất cả các mẫu nem chua đều chưa phát hiện nấm mốc bằng mắt thường kể cả trên nem và trên lá gói. Hầu hết các mẫu nem đều có vị chua vừa phải, rất vừa ăn. Tuy nhiên, ở các chỉ tiêu khác, sự khác biệt thể hiện rõ hơn giữa năm mẫu nem. Cụ thể ở chỉ tiêu màu sắc, nem chua được đánh giá đạt khi có màu hồng tươi hoặc hơi đỏ của thịt. Chỉ có 3 loại nem từ Cái Răng đạt chỉ tiêu này, trong khi đó mẫu nem Tư Kiên có màu đỏ đậm còn mẫu nem từ chợ Xuân Khánh lại có màu quá nhạt.
Hình 6: Màu sắc các mẫu nem chua
Ghi chú: (a) Mẫu nem chợ Xuân Khánh, (b) Mẫu nem Thu Oanh – Cái Răng, (c) Mẫu nem Tư Kiên - Lai Vung.
Về mùi thơm, các mẫu nem thường có mùi thơm đặc trưng của sản phẩm lên men acid lactic nên sẽ có mùi hơi chua, mùi thơm của thịt và mùi lá. Nem Tư Kiên lại có mùi hơi nồng trong khi đó nem chợ Xuân Khánh lại hơi nhạt mùi.