Nguyên tắc: Phuofng pháp dựa trên phản ứng hạt nhân giữa bia và chất cần
phân tích với dòng nơtron sinh ra từ các lò phản ứng hạt nhân khi mẫu được chiếu trong lò phản ứng vói thòd gian chiếu tỷ lệ thuận vói hàm lượng nguyên tố cần xác định, thiết diện phản ứng và mật độ dòng nơtron.
Đối vói một số nguyên tố có hàm lượng nhỏ trong mẫu phân tích, để tăng độ nhạy của phương pháp, ta có thể làm giàu mẫu phằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, phương pháp nung luyện, chiết và đồng kết tủa, hấp phụ...
Phương pháp này có độ nhạy cao, sai số không quá 10% vói hàm lượng mẫu cỡ mcg/g, thậm chí còn ở cỡ ng/g trong điều kiện tối ưu.
3.4. Các phương pháp sắc ký
3.4.1. Phương pháp sắc ký khí [18]
Nguyên tắc: sắc ký khí là phương pháp sắc ký mà pha động là chất khí hoặc
ở dạng hơi. Mẫu khảo sát dạng lỏng được bơm vào bộ phận nạp mẫu sau đó được khí mang dẫn vào hệ thống cột tách. Sau khi được tách các cấu tử đi qua detector và được chuyển thành tín hiệu dưód dạng pic trên sắc đồ.
Ngày nay sắc ký khí đã trở thành một trong những phương pháp quan trọng nhất để tách, xác định cấu trúc, nghiên cứu các thông số hoá lý... của các hợp chất. Sắc ký khí cũng thích hợp để phân tích dầu mỏ và các sản phẩm của chúng, các loại thực phẩm, dược phẩm, các chỉ tiêu hoá học môi trường...
3.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]
Nguyên tắc: sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng
chất nhồi có kích thước rất nhỏ ( 5 - 1 0 mcm) và sử dụng bơm cao áp để đẩy pha động đi qua cột tách nên có hiệu quả tách cao hơn nhiều so vói phương pháp sắc ký lỏng cổ điển.
Phương pháp có rất nhiều ưu điểm như tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ phân giải cao, cột tách có thể sử dụng nhiều lần, khả năng thu hồi mẫu cao vì hầu hết các detector không phá huỷ mẫu.
3.5.1. Phương pháp phổ phát xạ nguyên tử [18]
Nguyên tắc: Vô cơ hoá mẫu và chuyển các nguyên tố cần phân tích về dạng
dung dịch rồi tiến hành nguyên tử hoá các nguyên tố thành đám hơi nguyên tử ở trạng thái tự do. Sau đó kích thích đám hơi nguyên tử này bằng bức xạ điện từ và tiến hành đo bước sóng, cường độ và các đặc trưng khác của bức xạ điện từ được phát ra. Nồng độ các nguyên tố trong mẫu nghiên cứu tỷ lệ với cường độ vạch phổ phát xạ.
Phương pháp phổ phát xạ nguyên tử được áp dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực khoa học-kỹ thuật như nghiên cứu vũ trụ, kiểm tra sản phẩm luyện kim, phân tích đất đá, phân tích các đối tượng môi trưòfng-y-sinh học... Tuy nhiên, độ chính xác và độ chính xác của phương pháp không cao như các phương pháp phổ khác. Độ nhạy của phương pháp chỉ khoảng Ippm.
3.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang [18]
Nguyên tắc: Cho chất cần phân tích phản ứng với các thuốc thử thích hợp để
tạo hợp chất phát quang, sau đó kích thích bằng bức xạ điện từ rồi đo cường độ vạch phát quang. Nồng độ chất phát quang tỷ lệ với cường độ vạch phát quang.
Phổ huỳnh quang có thể áp dụng để phân tích các chất ở nồng độ rất nhỏ (10'^% -10'^%) với sai s ố tương đối l à 5 -1%.
Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện các nguyên tố bằng phép đo phổ huỳnh quang nguyên tử dùng ngọn lửa
Nguyên tố Độ dài sóng (nm) Giói hạn phát hiện (ppm)
As 328,1 0 ,0 0 1
Pb 405,8 0 ,0 1
Hg 253,7 0 , 0 0 0 2
Nguyên tắc: Sau khi được vô cơ hoá về dạng vô cơ và chuyển về dạng dụng
dịch, các nguyên tố cần xác định sẽ được nguyên tử hoá trở thành đám hoi nguyên tử tự do và sẽ hấp thụ chùm tia sáng có bước sóng tương ứng vód mỗi nguyên tố. Hàm lượng các nguyên tố có trong mẫu tỷ lệ với cưèmg độ hấp thụ và tuân theo định luật Lambert-Beer.
Quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp định lượng kim loại nặng trong các mẫu nghiên cứu thông dụng và phổ biến nhất hiện nay [47],[48],[49]. Phương pháp có thể được sử dụng để phân tích hơn 70 nguyên tố (Mg, Zn, Cu, Pb, Fe, N, Hg, Cd, Au... ) trong nhiều đối tượng phân tích khác nhau (hợp kim, kim loại, khoáng vật, các mẫu sinh học, đất-nước-không khí...) ngay cả khi chúng có hàm lượng rất thấp trong mẫu phân tích (1 0'^ - 1 0'®%), sai số phân tích dao động trong khoảng 3 -10% .
Qua các tài liệu thu thập được có thể thấy có nhiều phương pháp vật lý, hoá học và hoá lý có thể sử dụng để định lượng kim loại nặng trong các mẫu nghiên cứu. Mỗi phương pháp đều có ưu-nhược điểm và phạm vi áp dụng nhất định. Việc lựa chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào điều kiện, trang thiết bị hiện có và yêu cầu phân tích. Tài liệu của WHO năm 1996 [50] đã khuyến nghị lựa chọn phương pháp phân tích As, Pb, Hg, Cd trong phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển. Việc lựa chọn theo khuyến nghị của WHO được tóm tắt ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kỹ thuật phân tích đặc hiệu vén từng nguyên tố phù hợp với nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển [50]
Kỹ thuật phân tích Nguyên tố Đơn giản,
dễ thực hiện Khó nhưng có tính khả thi ít dùng do chi phí cao As So màu Phổ hấp thụ nguyên tử Kích hoạt nơtron Phổ huỳnh quang
Pb Von - ampe hoà tan Phổ hấp thụ nguyên tử Phổ phát xạ nguyên tử
Phổ huỳnh quang
Hg So màu Phổ hấp thụ nguyên tử
Kích hoạt nơtroĩi
Sắc ký khí Cd Von - ampe hoà tan Phổ hấp thụ nguyên tử
Kích hoạt noỉtron
PHẦN 4: NHỮNG QUI ĐỊNH VỂ GIỚI HẠN KIM LOẠI NẶNG TRONG D ư ợ c ĐIỂN MỘT số Nưòc VÀ TRONG
MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN cứu
4.1. Qui định về giói hạn kim loại nặng trong Dược điển một số nước
Các Dược điển được tham khảo đều qui định giới hạn kim loại nặng đối với các chuyên luận hoá dược. Thông thường giói hạn kim loại nặng nói chung vào khoảng 1-10 ppm còn giód hạn Asen thường không quá 5 ppm tuỳ theo từng chuyên luận. Trong số các Dược điển đã tham khảo, tất cả các Dược điển đều có chuyên luận thử giới hạn kim loại nặng nói chung và thử giới hạn Asen. Riêng Dược điển Mỹ 26, 27, 28, 29 có thêm 2 chuyên luận thử giới hạn Chì và thử giới hạn Thuỷ ngân. Qui định thử giới hạn kim loại nặng trong Dược điển một số nước được tóm tắt trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Qui định thử giới hạn kim loại nặng trong Dược điển một số nước.
Các Dược điển
Phương pháp thử Kìm loại
nặng nói chung
Asen Chì Thuỷ ngân
Dược điển Việt Nam 3 [2]
So màu So màu
Dược điển Anh 2001 [32] Dược điển Trung Quốc 1997, 2000 [33],[34]
Dược điển Châu Âu 4 [35] Dược điển Quốc tế 1997 [36] Dược điển Hàn Quốc 8 [37] Dược điển Nhật Bản 12 [38] Dược điển Mỹ 26, 27, 28,29
[39],[40],[41],[42] So màu So màu So màu
Chuẩn độ Dithizon
Từ bảng 4.1 có thể nhận thấy các phưoỉng pháp xác định giới hạn kim loại nặng đối vói các chuyên luận hoá dược mà các Dược điển đã tham khảo đang sử dụng hầu hết là phương pháp so màu, ngoại trừ Dược điển Mỹ [39],[40],[41],[42] có sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử trong thử giới hạn Thuỷ ngân.
Trong số các Dược điển tham khảo, chỉ có Dược điển Châu Âu 4 (2002) [35] và Dược điển Mỹ 26 (2003) [39] có đề cập đến việc kiểm tra kim loại nặng trong thuốc có nguồn gốc thảo dược nhưng chưa qui định cụ thể về giới hạn và phương pháp kiểm tra cụ thể với mỗi kim loại. Các Dược điển còn lại, trong đó có Dược điển Việt Nam III đều chưa qui định tiêu chuẩn xác định giới hạn kim loại nặng trong dược liệu và thuốc thảo dược.
4.2. Quỉ định về giới hạn kim loại năng trong dược liệu hay thuốc có nguồn gốc thảo dược trong một số công trình nghiên cứu
Giới hạn kim loại nặng trong thuốc nói chung và trong mỹ phẩm được qui định trong điều luật về chất độc ở Malaysia năm 1952 được xem xét lại năm 1989 qui định:
Chì đối vói chế phẩm có nguồn gốc thảo dược: <10 ppm
Asen đối vói thuốc nói chung: < 5 ppm
Thuỷ ngân đối với thuốc nói chung: < 0,5 ppm [13]
ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu xây dựng giới hạn và phương pháp thử kim loại nặng trong dược liệu và đã thu được một số kết quả nhất định.
Viện Dược liệu (10/2004) đã đưa ra tiêu chuẩn cơ sở dược liệu sạch của 4 dược liệu: Actisô (lá), Bạch chỉ (rễ), Cúc hoa, Đương qui di thực (rễ), Ngưu tất (rễ)
[19]. Trong đó qui định về giới hạn kim loại nặng như sau:
Asen: < 10 mg/kg (10 ppm) dược liệu khô kiệt Cadimi: < 1 mg/kg (1 ppm) dược liệu khô kiệt Chì: <10 mg/kg (10 ppm) dược liệu khô kiệt Thuỷ ngân: < 0,5 mg/kg (0,5 ppm) dược liệu khô kiệt
Phương pháp phân tích kim loại nặng được sử dụng là phuofng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Đối với Asen: Xử lý mẫu bằng phưoỉng pháp vô cơ hoá ướt dùng acid HNO3
65% và acid HCIO4 70%, nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hydrid hoá vód tác nhân khử là KI.
Đối với Chì, Cadỉmi: Xử lý mẫu bằng phương pháp ngâm - chiết nóng,
nguyên tử hoá bằng kỹ thuật không ngọn lửa trong lò graphit.
Đối với Thuỷ ngân: Xử lý mẫu bằng phưcmg pháp vô cơ hoá ngọn lửa trong
ống thuỷ tinh hàn kín, nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hoá hơi lạnh.
Cồng ty cổ phần TRAPHACO (11/2004) đã xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sạch cho một số dược liệu và thuốc thảo dược: Actiso (lá, cao đặc, cao khô), Bạch chỉ, Cúc hoa [19]. Trong đó qui định về giới hạn kim loại nặng như sau:
Asen: <1,2 ppm
Chì: < 10 ppm
Thuỷ ngân: < 1 ppm Cadimi: < 0,8 ppm
Phương pháp phân tích kim loại nặng được sử dụng là phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Đối với Asen: Xử lý mẫu bằng phưcmg pháp vô cơ hoá ướt dùng acid HNO3 và acid HCIO4, nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hydrid hoá với tác nhân K I trên ngọn
lửa không khí - acetylen.
Đối với Chì và Cadimi: Xử lý mẫu bằng phương pháp vô cơ hoá ướt với acid
HNO3 và acid HCIO4, nguyên tử hóa bằng kỹ thuật lò graphit.
Đối với Thuỷ ngân: Xử lý mẫu bằng phương pháp vô cơ hoá ngọn lửa trong
ống thuỷ tinh hàn kín, nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hoá hơi lạnh.
Tác giả Trịnh Văn Lẩu, Bùi Thị Hoà (2002) đã định lượng Chì và Đồng trong một số chế phẩm Đông dược có chứa tam thất bằng phưofng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [7].
Phương pháp xử lý mẫu và định lượng: Xử lý mẫu bằng 2 phương pháp: phương pháp 1 là vô cơ hoá ướt dùng acid HNO3 65% và acid HCIO4 70%; phương
pháp 2 là vô cơ hoá mẫu bằng lò vi sóng, sử dụng acid HNO3 10% và H2O2. Nguyên tử hoá bằng kỹ thuật không ngọn lửa trong cuvet graphit bao hoạt hoá nhiệt.
Kết quả định lượng Chì trong các mẫu nghiên cứu cho thấy hàm lượng Chì dao động trong khoảng 0,40 - 0,66 mcg/g (ppm). So với các tiêu chuẩn đã nói ở
trên, khoảng nồng độ này nằm trong giới hạn cho phép.
Kết quả nghiên cứu đã cho thấy phương pháp định lượng Chì bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa có độ đúng và độ chính xác cao, đặc hiệu vói nguyên tố cần phân tích, rất thích hợp cho việc xác định hàm lượng Chì trong các đối tượng dược liệu có thành phần phức tạp. Để xử lý mẫu trước khi định lượng có thể sử dụng 2 phưoỉng pháp vô cơ hoá ướt và phương pháp vô cơ hoá trong lò vi sóng, hai phương pháp này cho kết quả tương đương về độ đúng và độ chính xác.
Các tác giả Phan Túy, Phạm Thị Mận (2001) đã nghiên cứu định lượng Thuỷ ngân trong một số vị thuốc Đông dược bằng phuofng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [9].
Phưoìig pháp xử lý mẫu và định lượng: Vố cơ hoá mẫu bằng acid HNO3 trong lò vi sóng. Nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hoá hơi lạnh với tác nhân khử hoá là SnClj.
Trong công trình này, các tác giả nghiên cứu trên 54 vị thuốc đã được chế biến và bán ở một số hiệu thuốc. Kết quả định lượng Thuỷ ngân trong các mẫu nghiên cứu cho thấy hàm lượng Thuỷ ngân dao động trong khoảng 0,108 - 0,958 mcg/g (ppm), cao nhất ỏ các vị dược liệu: Đan sâm, Cốt toái bổ, Bạch truật, cẩu
tích, Câu kỷ tử, thấp nhất ở các vị dược liệu: Câu đằng, Đương qui, Táo nhân, Đỗ trọng, Nhục thung dung. Hàm lượng Thuỷ ngân trong các mẫu dược liệu hầu hết đều nằm trong giới hạn cho phép của các tiêu chuẩn đã nêu [13],[18]. Tuy nhiên có 3 vị dựơc liệu là Đan sâm, Cốt toái bổ, Bạch truật có hàm lượng Thuỷ ngân vượt quá tiêu chuẩn cho phép của Malaỵsia [13] và Viện Dược liệu Việt Nam [19] ( cao hơn 5 ppm).
Các tác giả đánh giá phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp có độ ổn định và độ chọn lọc cao trong phép định lượng vết kim loại. Đối với
Thuỷ ngân, nguyên tố dễ bay hcd, giai đoạn xử lý mẫu có vai trò đặc biệt quan trọng. Kết quả thực nghiệm cho thấy, dùng lò vi sóng để xử lý mẫu trong phép định lượng Thuỷ ngân trong dược liệu rất thuận lợi và cho kết quả tốt. về kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu, đối vói Thuỷ ngân, phải dùng kỹ thuật hoá hoi lạnh để hoá mẫu. Chất khử có thể là NaBIỈ4 hoặc SnClj nhưng sử dụng SnClj với nồng độ thích hợp vừa ít tốn kém lại cho kết quả tốt hơn.
Các tác giả Bùi Thị Hoà, Nguyễn Văn Hà, Trịnh Văn Lẩu (2003) đã xác định hàm lượng Asen trong một số thuốc đông dược bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [4].
Phương pháp xử lý mẫu và định lượng: Xử lý mẫu bằng đun trên bếp vói acid HNO3 65%. Nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hydrid hoá với tác nhân khử hoá là Natri borohydrid NaBỈỈ4, phân tích trên ngọn lửa acetylen - không khí nén.
Kết quả định lượng Asen trong mẫu nghiên cứu cho thấy hàm lượng Asen nằm trong khoảng 0,51 - 1,15 mcg/g (ppm). Khoảng nồng độ này nằm trong giới hạn cho phép của các tiêu chuẩn đã nêu [13],[19].
Kết quả xây dựng phưoíng pháp định lượng Asen trong thuốc thảo dược cho thấy phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử vói kỹ thuật xử lý mẫu vô cơ hoá ướt và nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hydrit hoá có độ nhạy cao, độ lặp lại và độ đúng tương đối tốt. Phương pháp có thể áp dụng cho những cơ sở sản xuất thuốc thảo dược cũng như trung tâm kiểm nghiệm có máy quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Qua các tài liệu thu thập được có thể thấy 4 nguyên tố Asen, Chì, Thuỷ ngân, Cadimi là những kim loại nặng có độc tính cao đối với người và động vật. Các kim loại này gây ra sự suy giảm chức năng của hầu hết các cơ quan trong cơ thể người và động vật khi bị nhiễm độc. Việc khai thác, chế biến, sử dụng kim loại nặng và các sản phẩm chứa kim loại nặng (xăng pha chì, thuốc trừ sâu, kem trắng da, các dụng cụ điện và bán dẫn...) một cách thiếu kiểm soát đã gây ra sự ô nhiễm các kim loại nặng trong đất, nước và không khí ngày càng tăng làm cho nguy cơ gây nhiễm độc đối với con ngưcd cũng ngày càng tăng theo. Để nâng cao tính an toàn của thuốc chữa bệnh, việc qui định giới hạn kim loại nặng (As, Pb, Hg, Cd) trong dược liệu và thuốc thảo dược là hết sức cần thiết.
Dược điển Việt Nam III và Dược điển nhiều nước đều chưa qui định tiêu chuẩn và phưoíng pháp thử giód hạn kim loại nặng (As, Pb, Hg, Cd) trong dược liệu và thuốc có nguồn gốc thảo dược. Chỉ có Dược điển Châu Âu 4 (2002) và Dược điển Mỹ 26 (2003) có đề cập việc này nhưng cũng chưa qui định cụ thể về giói hạn và phương pháp kiểm tra. ở Việt nam, một số nghiên cứu về vấn đề xây dựng phưofng pháp xác định hàm lượng kim loại nặng trong dược liệu đã được tiến hành song nói chung còn ít, chưa được hệ thống và đầy đủ. Một số cơ sở như Viện Dược liệu, công