2.4.8.1. Sự vận chuyển Camỉdỉ qua màng tế bào
lon và nhiều ion kim loại hoá trị 2 (như Pb^^) không được vận chuyển chủ động qua màng tế bào. Trong khi đó, sự hấp thu Cadimi lại tăng lên khi chế độ ăn thiếu sắt. Nguyên nhân là do được vận chuyển cạnh trạnh với qua màng nhờ một loại protein vận chuyển, gọi là chất vận chuyển ion kim loại hoá trị 2
(Divalent metal transporter) [20],[28].
2.4.8.2. Sự bùng phát các gốc tự do (oxidative stress)
Không chỉ Cadimi mà nhiều kim loại nặng khác (As, Pb, Hg...) đã được chứng minh là những tác nhân gây bùng phát các gốc tự do trong tế bào. Các kim
loại nặng này có thể xúc tác hay tham gia phản ứng oxi hoá của các phân tử sinh học làm phát sinh các gốc tự do. Mặt khác chúng có thể làm cạn kiệt các chất chống gốc tự do trong cơ thể. Kết quả là số lượng các gốc tự do như hydroxyl (HO*), superoxid (0 2~ *)... tăng vọt và đe doạ hàng rào bảo vệ của tế bào. Các gốc tự do này tham gia phản ứng oxy hoá các phân tử lipid màng (phản ứng POL), các protein và cả các acid nucleic (ADN, ARN) từ đó làm rối loạn chức năng của tế bào và gây ra hàng loạt các bệnh lý [24].
2.4.83. Sự ảnh hưởng đến Hem oxygenase-1 ở người
Trong cơ thể, Hem là thành phần của nhiều protein như Hemoglobin, Myoglobin, Cytochrom hay các enzym như Nitric oxide synthetase, Catalase, Peroxidase, Oxidase và Pyrolase...[27]. Bình thường trong cơ thể tồn tại cân bằng giữa tổng hợp và thoái hoá Hem. ở trạng thái bệnh lý, sự mất ổn định của các protein chứa Hem làm giải phóng Hem một cách tự do. Hem tự do là tác nhân gây tổn thương nhiều đích trong tế bào như ty thể, cytoskeleton, nhân và một số enzym nội bào, kết quả là gây rối loạn chức năng của tế bào [27]. Hem oxygenase-1 là enzym xúc tác quá trình mở vòng Hem giải phóng biliverdin, sắt và carbon monoxyd (CO) nên nó có vai trò quan trọng để chống oxy hoá, chống viêm do Hem gây ra [27].
Hemoxygenase-1 bị khử hoạt tính bỏi nhiều yếu tố như Cadimi, Lipoprotein phân tử lượng thấp (LDL) hay các cytokine theo những cơ chế rất phức tạp. Những trưòfng hợp nhiễm độc Cadimi vì thế đều thiếu hụt enzym này gây nhiều bệnh như xơ vữa động mạch, khí thũng ở người [27].
PHẦN 3: MỘT s ố PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG KIM• • •
LOẠI NẶNG TRONG MÂU NGHIÊN cứu
3.1. Phưong pháp so màu [3],[18]
Nguyên tắc: Hoà tan chất cần phân tích vào một dung môi thích hợp rồi cho
tác dụng với thuốc tạo phức trong điều kiện nhất định, sau đó đem so màu của dung dịch thử và dung dịch chuẩn hoặc đo mật độ quang của các dung dịch này.
Một số thuốc thử hữu cơ thường dùng để tạo phức màu với kim loại là Dithizon, 8-oxiquinolin, Cuppheron, Acetyl Aceton, Dietyl thiocarbamat, di-p- naptyl thiocarbazon, trong đó Dithizon được sử dụng nhiều nhất.
Đối vói Chì, có thể tạo phức Dithizonat - Chì có màu đỏ tía rồi chiết phức này bằng Cloroĩorm ở pH = 7 - 10, sau đó đo mật độ quang của dịch chiết Cloroíorm ở bước sóng 520nm.
Đối với Thuỷ ngân có thể dùng phản ứng giữa và KI tạo ra Hglí, sau đó Hgl2 kết hợp với Cul tạo phức màu hồng Cu2[Hgl4]. Thuỷ ngân cũng có thể tạo phức với Dithizon ở pH = 0,5 - 1, dịch chiết tetraclo carbon (CCI4) có thể đem đo quang ở bước sóng 485nm.
Phương pháp này có ưu điểm là có thể chiết chọn lọc các ion kim loại bằng cách thay đổi pH môi trường, thòi gian phân tích ngắn và chỉ cần dụng cụ đơn giản. Song nhược điểm của nó là không xác định được chất phân tích khi nồng độ thấp. Trong trường hợp này, thường phải làm giàu nguyên tố phân tích, thông thường là cô mẫu thử. Thao tác này dễ làm mất mẫu và gây nhiễm bẩn mẫu do hoá chất và môi trường.
3.2. Các phương pháp điện hoá
3.2.1. Phương pháp cực phổ xung vi phân [18]
Nguyên tắc: Phân cực điện cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến
tính với tốc độ chậm (l-2mV/s). Đến cuối thời gian tồn tại của giọt thì bổ sung một điện áp có biên độ không lớn lắm (10 - lOOmV) và kéo dài khoảng 400 giây. Đo
cường độ dòng cực phổ trước khi đặt xung và sau khi ngắt xung, xác định hiệu số cưòfng độ dòng (AI). AI được ghi như một hàm thay đổi tuyến tính của E, đường AI - E có dạng một cực trị (pic cực đại).
ư u điểm của phưoỉng pháp là độ nhạy khá cao (có thể đến 10'^M) cho cả hợp chất vô cơ và hữu cơ. Phưoỉng pháp có độ phân giải rất cao, ví dụ có thể ghi sóng cực phổ dung dịch chứa 10'^M Cd^^khi có mặt 5.10'^M mà không cần tách chúng. Đây còn là phương pháp rất dễ thực hiện quá trình tự động hoá nên có thể cho phép thực hiện phân tích 200 - 300 mẫu trong một ca làm việc.
3.2.2. Phương pháp V on-A m pe hoà tan [5],[14],[18] Nguyên tắc: Phương pháp gồm 2 bước sau:
+ Điện phân để làm giàu chất cần phân tích lên bề mặt điện cực hoạt động dưói dạng kết tủa vói điện thế của điện cực tương ứng với điện thế dòng giới hạn.
+ Hoà tan kết tủa đã được làm giàu và ghi đo đưòfng Von- Ampe hoà tan. Trên đường Von- Ampe hoà tan xuất hiện pic của chất cần xác định.
ư u điểm của phương pháp là độ nhạy cao (có thể xác định các nguyên tố trong khoảng nồng độ 1 0'^ - 1 0'^ mol/1), độ chính xác khá cao, cho phép xác định đồng thời nhiều ion kim loại trong thời gian ngắn, máy móc thiết bị phổ biến không quá đắt. Nhược điểm của phương pháp là phải sử dụng nhiều hoá chất nền nên dễ nhiễm tạp chất.
3.2.3. Phương pháp chuẩn độ Ampe [18]
Nguyên tắc: Đo cường độ dòng của dung dịch chứa ion khảo sát ở điện thế tương ứng với điện thế dòng giới hạn sau mỗi lần thêm vào dung dịch một lượng chất chuẩn xác định, sau đó lập đường biến thiên của cường độ dòng theo thể tích dung dịch chuẩn thêm vào và xác định điểm tương đương của quá trình chuẩn độ.
Bằng phưofng pháp này có thể định lượng được rất nhiều ion kim loại như Bi^^, Cd^^, Pb^^, Zn^^... thông qua phản ứng tạo thành các complexonat kim loại nhờ EDTA ở các điều kiện pH khác nhau, nhờ vậy có thể xác định được từng ion trong
3.3. Phương pháp kích hoạt nơtron [18]
Nguyên tắc: Phuofng pháp dựa trên phản ứng hạt nhân giữa bia và chất cần
phân tích với dòng nơtron sinh ra từ các lò phản ứng hạt nhân khi mẫu được chiếu trong lò phản ứng vói thòd gian chiếu tỷ lệ thuận vói hàm lượng nguyên tố cần xác định, thiết diện phản ứng và mật độ dòng nơtron.
Đối vói một số nguyên tố có hàm lượng nhỏ trong mẫu phân tích, để tăng độ nhạy của phương pháp, ta có thể làm giàu mẫu phằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, phương pháp nung luyện, chiết và đồng kết tủa, hấp phụ...
Phương pháp này có độ nhạy cao, sai số không quá 10% vói hàm lượng mẫu cỡ mcg/g, thậm chí còn ở cỡ ng/g trong điều kiện tối ưu.
3.4. Các phương pháp sắc ký
3.4.1. Phương pháp sắc ký khí [18]
Nguyên tắc: sắc ký khí là phương pháp sắc ký mà pha động là chất khí hoặc
ở dạng hơi. Mẫu khảo sát dạng lỏng được bơm vào bộ phận nạp mẫu sau đó được khí mang dẫn vào hệ thống cột tách. Sau khi được tách các cấu tử đi qua detector và được chuyển thành tín hiệu dưód dạng pic trên sắc đồ.
Ngày nay sắc ký khí đã trở thành một trong những phương pháp quan trọng nhất để tách, xác định cấu trúc, nghiên cứu các thông số hoá lý... của các hợp chất. Sắc ký khí cũng thích hợp để phân tích dầu mỏ và các sản phẩm của chúng, các loại thực phẩm, dược phẩm, các chỉ tiêu hoá học môi trường...
3.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18]
Nguyên tắc: sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng
chất nhồi có kích thước rất nhỏ ( 5 - 1 0 mcm) và sử dụng bơm cao áp để đẩy pha động đi qua cột tách nên có hiệu quả tách cao hơn nhiều so vói phương pháp sắc ký lỏng cổ điển.
Phương pháp có rất nhiều ưu điểm như tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ phân giải cao, cột tách có thể sử dụng nhiều lần, khả năng thu hồi mẫu cao vì hầu hết các detector không phá huỷ mẫu.
3.5.1. Phương pháp phổ phát xạ nguyên tử [18]
Nguyên tắc: Vô cơ hoá mẫu và chuyển các nguyên tố cần phân tích về dạng
dung dịch rồi tiến hành nguyên tử hoá các nguyên tố thành đám hơi nguyên tử ở trạng thái tự do. Sau đó kích thích đám hơi nguyên tử này bằng bức xạ điện từ và tiến hành đo bước sóng, cường độ và các đặc trưng khác của bức xạ điện từ được phát ra. Nồng độ các nguyên tố trong mẫu nghiên cứu tỷ lệ với cường độ vạch phổ phát xạ.
Phương pháp phổ phát xạ nguyên tử được áp dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực khoa học-kỹ thuật như nghiên cứu vũ trụ, kiểm tra sản phẩm luyện kim, phân tích đất đá, phân tích các đối tượng môi trưòfng-y-sinh học... Tuy nhiên, độ chính xác và độ chính xác của phương pháp không cao như các phương pháp phổ khác. Độ nhạy của phương pháp chỉ khoảng Ippm.
3.5.2. Phương pháp phổ huỳnh quang [18]
Nguyên tắc: Cho chất cần phân tích phản ứng với các thuốc thử thích hợp để
tạo hợp chất phát quang, sau đó kích thích bằng bức xạ điện từ rồi đo cường độ vạch phát quang. Nồng độ chất phát quang tỷ lệ với cường độ vạch phát quang.
Phổ huỳnh quang có thể áp dụng để phân tích các chất ở nồng độ rất nhỏ (10'^% -10'^%) với sai s ố tương đối l à 5 -1%.
Bảng 3.1. Giới hạn phát hiện các nguyên tố bằng phép đo phổ huỳnh quang nguyên tử dùng ngọn lửa
Nguyên tố Độ dài sóng (nm) Giói hạn phát hiện (ppm)
As 328,1 0 ,0 0 1
Pb 405,8 0 ,0 1
Hg 253,7 0 , 0 0 0 2
Nguyên tắc: Sau khi được vô cơ hoá về dạng vô cơ và chuyển về dạng dụng
dịch, các nguyên tố cần xác định sẽ được nguyên tử hoá trở thành đám hoi nguyên tử tự do và sẽ hấp thụ chùm tia sáng có bước sóng tương ứng vód mỗi nguyên tố. Hàm lượng các nguyên tố có trong mẫu tỷ lệ với cưèmg độ hấp thụ và tuân theo định luật Lambert-Beer.
Quang phổ hấp thụ nguyên tử là phương pháp định lượng kim loại nặng trong các mẫu nghiên cứu thông dụng và phổ biến nhất hiện nay [47],[48],[49]. Phương pháp có thể được sử dụng để phân tích hơn 70 nguyên tố (Mg, Zn, Cu, Pb, Fe, N, Hg, Cd, Au... ) trong nhiều đối tượng phân tích khác nhau (hợp kim, kim loại, khoáng vật, các mẫu sinh học, đất-nước-không khí...) ngay cả khi chúng có hàm lượng rất thấp trong mẫu phân tích (1 0'^ - 1 0'®%), sai số phân tích dao động trong khoảng 3 -10% .
Qua các tài liệu thu thập được có thể thấy có nhiều phương pháp vật lý, hoá học và hoá lý có thể sử dụng để định lượng kim loại nặng trong các mẫu nghiên cứu. Mỗi phương pháp đều có ưu-nhược điểm và phạm vi áp dụng nhất định. Việc lựa chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào điều kiện, trang thiết bị hiện có và yêu cầu phân tích. Tài liệu của WHO năm 1996 [50] đã khuyến nghị lựa chọn phương pháp phân tích As, Pb, Hg, Cd trong phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển. Việc lựa chọn theo khuyến nghị của WHO được tóm tắt ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kỹ thuật phân tích đặc hiệu vén từng nguyên tố phù hợp với nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển [50]
Kỹ thuật phân tích Nguyên tố Đơn giản,
dễ thực hiện Khó nhưng có tính khả thi ít dùng do chi phí cao As So màu Phổ hấp thụ nguyên tử Kích hoạt nơtron Phổ huỳnh quang
Pb Von - ampe hoà tan Phổ hấp thụ nguyên tử Phổ phát xạ nguyên tử
Phổ huỳnh quang
Hg So màu Phổ hấp thụ nguyên tử
Kích hoạt nơtroĩi
Sắc ký khí Cd Von - ampe hoà tan Phổ hấp thụ nguyên tử
Kích hoạt noỉtron
PHẦN 4: NHỮNG QUI ĐỊNH VỂ GIỚI HẠN KIM LOẠI NẶNG TRONG D ư ợ c ĐIỂN MỘT số Nưòc VÀ TRONG
MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN cứu
4.1. Qui định về giói hạn kim loại nặng trong Dược điển một số nước
Các Dược điển được tham khảo đều qui định giới hạn kim loại nặng đối với các chuyên luận hoá dược. Thông thường giói hạn kim loại nặng nói chung vào khoảng 1-10 ppm còn giód hạn Asen thường không quá 5 ppm tuỳ theo từng chuyên luận. Trong số các Dược điển đã tham khảo, tất cả các Dược điển đều có chuyên luận thử giới hạn kim loại nặng nói chung và thử giới hạn Asen. Riêng Dược điển Mỹ 26, 27, 28, 29 có thêm 2 chuyên luận thử giới hạn Chì và thử giới hạn Thuỷ ngân. Qui định thử giới hạn kim loại nặng trong Dược điển một số nước được tóm tắt trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Qui định thử giới hạn kim loại nặng trong Dược điển một số nước.
Các Dược điển
Phương pháp thử Kìm loại
nặng nói chung
Asen Chì Thuỷ ngân
Dược điển Việt Nam 3 [2]
So màu So màu
Dược điển Anh 2001 [32] Dược điển Trung Quốc 1997, 2000 [33],[34]
Dược điển Châu Âu 4 [35] Dược điển Quốc tế 1997 [36] Dược điển Hàn Quốc 8 [37] Dược điển Nhật Bản 12 [38] Dược điển Mỹ 26, 27, 28,29
[39],[40],[41],[42] So màu So màu So màu
Chuẩn độ Dithizon
Từ bảng 4.1 có thể nhận thấy các phưoỉng pháp xác định giới hạn kim loại nặng đối vói các chuyên luận hoá dược mà các Dược điển đã tham khảo đang sử dụng hầu hết là phương pháp so màu, ngoại trừ Dược điển Mỹ [39],[40],[41],[42] có sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử trong thử giới hạn Thuỷ ngân.
Trong số các Dược điển tham khảo, chỉ có Dược điển Châu Âu 4 (2002) [35] và Dược điển Mỹ 26 (2003) [39] có đề cập đến việc kiểm tra kim loại nặng trong thuốc có nguồn gốc thảo dược nhưng chưa qui định cụ thể về giới hạn và phương pháp kiểm tra cụ thể với mỗi kim loại. Các Dược điển còn lại, trong đó có Dược điển Việt Nam III đều chưa qui định tiêu chuẩn xác định giới hạn kim loại nặng trong dược liệu và thuốc thảo dược.
4.2. Quỉ định về giới hạn kim loại năng trong dược liệu hay thuốc có nguồn gốc thảo dược trong một số công trình nghiên cứu
Giới hạn kim loại nặng trong thuốc nói chung và trong mỹ phẩm được qui định trong điều luật về chất độc ở Malaysia năm 1952 được xem xét lại năm 1989 qui định:
Chì đối vói chế phẩm có nguồn gốc thảo dược: <10 ppm
Asen đối vói thuốc nói chung: < 5 ppm
Thuỷ ngân đối với thuốc nói chung: < 0,5 ppm [13]
ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu xây dựng giới hạn và phương pháp thử kim loại nặng trong dược liệu và đã thu được một số kết quả nhất định.
Viện Dược liệu (10/2004) đã đưa ra tiêu chuẩn cơ sở dược liệu sạch của 4 dược liệu: Actisô (lá), Bạch chỉ (rễ), Cúc hoa, Đương qui di thực (rễ), Ngưu tất (rễ)
[19]. Trong đó qui định về giới hạn kim loại nặng như sau:
Asen: < 10 mg/kg (10 ppm) dược liệu khô kiệt Cadimi: < 1 mg/kg (1 ppm) dược liệu khô kiệt Chì: <10 mg/kg (10 ppm) dược liệu khô kiệt Thuỷ ngân: < 0,5 mg/kg (0,5 ppm) dược liệu khô kiệt
Phương pháp phân tích kim loại nặng được sử dụng là phuofng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Đối với Asen: Xử lý mẫu bằng phưoỉng pháp vô cơ hoá ướt dùng acid HNO3
65% và acid HCIO4 70%, nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hydrid hoá vód tác nhân khử là KI.
Đối với Chì, Cadỉmi: Xử lý mẫu bằng phương pháp ngâm - chiết nóng,
nguyên tử hoá bằng kỹ thuật không ngọn lửa trong lò graphit.
Đối với Thuỷ ngân: Xử lý mẫu bằng phưcmg pháp vô cơ hoá ngọn lửa trong
ống thuỷ tinh hàn kín, nguyên tử hoá bằng kỹ thuật hoá hơi lạnh.
Cồng ty cổ phần TRAPHACO (11/2004) đã xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sạch cho một số dược liệu và thuốc thảo dược: Actiso (lá, cao đặc, cao khô), Bạch chỉ, Cúc hoa [19]. Trong đó qui định về giới hạn kim loại nặng như sau: