Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất đều tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó.
Có bốn phương pháp được sử dụng trong sắc ký.
2.5.3.1 Phương pháp chuẩn ngoại
Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả hai mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. So sách diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử. [15]
Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hay nhiều điểm.
a) Chuẩn hóa một điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức. [15]
. x x s s S C C S Ở đây: Cx là nồng độ của mẫu thử
Cs là nồng độ của mẫu chuẩn
Sx(Hx) là diện tích (chiều cao) của peak mẫu thử
Ss(Hs) là diện tích (chiều cao) của peak mẫu chuẩn
b) Chuẩn hóa nhiều điểm
Tiến hành qua các bước sau: [15]
− Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là diện tích hoặc chiều cao peak ở mỗi điểm chuẩn.
− Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) peak với nồng độ chất chuẩn C.
ĐỖ CAO VINH 27
Hình 2.8: Đồ thị phương pháp chuẩn ngoại
Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể thực hiện việc tính toán theo hai cách: [15]
− Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) peak của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó.
− Xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) peak với nồng độ của chất cần phân tích.
x
y a bC
Trong đó
y: là diện tích peak
a: là giao điểm của đường chuẩn với trục tung
b: là độ dốc của đường chuẩn
Cx: là nồng độ của chất thử
Dựa vào phương trình hồi qui này ta tính được nồng độ chất thử
x y a C b
Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn.
2.5.3.2 Phương pháp chuẩn nội
Phương pháp chuẩn nội giúp khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại khi phân tích những mẫu phải xử lý phức tạp và đặc
x Sx S S1 S2 Cx C 2.2 2.3
ĐỖ CAO VINH 28
biệt là các mẫu vừa phức tạp vừa có hàm lượng thấp của chất cần phân tích. [15]
Kỹ thuật chuẩn nội có thể được tóm tắt như sau: Người ta thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là chuẩn nội.
Từ những dữ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) peak và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của phần cần định lượng trong mẫu thử một cách chính xác. [15]
Có một số yêu cầu đặt ra với chất chuẩn nội: [15]
− Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
− Có cấu trúc hóa học tương đương như chất thử − Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử
− Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử − Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm
Vì rằng đáp ứng của chất chuẩn và chuẩn nội với detector không cùng độ nhạy, nên trước hết cần phải xác định hệ số đáp ứng để hiệu chỉnh trong kết quả.
a) Xác định hệ số đáp ứng Fx
Chuẩn bị một hỗn hợp có chứa những lượng (hoặc nồng độ) đã biết của chất chuẩn và chuẩn nội rồi chạy sắc ký. Sắc đồ thu được sẽ cho ta biết các dữ liệu về diện tích các peak. [15]
Trong phương pháp chuẩn nội, người ta thấy có mối tương quan giữa tỷ số của khối lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn và chuẩn nội với tỷ số diện tích của hai peak. Và hệ số đáp ứng được tính theo phương trình sau: [15]
Tính theo nồng độ ta có IS IS IS IS . : . C C C x C m S m S F m S m S IS IS . . c x C C S F C S Ở đây
mC, mIS lần lượt là khối lượng của chất chuẩn và chuẩn nội
CC, CIS lần lượt là nồng độ của chất chuẩn và chuẩn nội 2.4
ĐỖ CAO VINH 29
SC, SIS lần lượt là diện tích peak chuẩn và chuẩn nội
Các sai số sẽ được cực tiểu hóa nếu hệ số Fx xấp xỉ đơn vị, có nghĩa là chất chuẩn và chuẩn nội có cùng đáp ứng với detector. Tuy nhiên trong thực tế điều này thường khó đạt được hoàn hảo. [15]
b) Định lượng thành phần trong mẫu thử
Phương pháp chuẩn một điểm: [15]
− Chuẩn nội được thêm vào cả hai, mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký.
− Lượng hoặc nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau
IS IS T T x S m m F S − Tính theo nồng độ ta có IS IS T T x S C C F S
Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm: [15]
− Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa những lượng (hoặc nồng độ) chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng (hoặc nồng độ) chuẩn nội. Sau khi sắc ký và thu được các dữ kiện về diện tích, tiến hành vẽ đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) peak của chuẩn trên chuẩn nội (SS/SIS) với tỷ số của nồng độ chuẩn ngoại trên chuẩn nội (CS/CIS).
Hình 2.9: Phương pháp đường chuẩn sử dụng chuẩn nội
CX/CIS SX/SIS SS/SIS CS/CIS 2.5 2.6
ĐỖ CAO VINH 30
− Song song tiến hành sắc ký mẫu thử cũng được thêm chuẩn nội với lượng (hoặc nồng độ) như thang chuẩn.
− Tính tỷ số diện tích (hoặc chiều cao) peak của chất thử trên diện tích (hoặc chiều cao) peak chuẩn nội (ST /SIS) rồi dựa vào đường chuẩn sẽ tìm được nồng độ của chất thử (CT).
2.5.3.3 Phương pháp thêm chuẩn
Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩn ngoại và chuẩn nội.
Ưu điểm của kỹ thuật thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ được sai số do các yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt là ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế các chất từ các dạng bào chế…) [15]
a) Kỹ thuật so sánh
Xử lý mẫu thử rồi tiến hành sắc ký.
Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết Cx của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ ΔC (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao) peak theo công thức [15]
x x C C S S
b) Kỹ thuật thêm đường chuẩn
Nguyên tắc: Chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và các chất chuẩn (tương ứng với các thành phần cần xác định) với lượng tăng dần. Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký. Dựng đường chuẩn tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao (H) của peak tổng (thử + chuẩn) với lượng hoặc nồng độ của chất chuẩn thêm (ΔC). Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành chính là nồng độ của chất cần xác định. [15]
ĐỖ CAO VINH 31
Hình 2.10: Đồ thị phương pháp thêm đường chuẩn
2.5.3.4 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích peak của nó so với tổng diện tích của tất cả các peak thành phần trên sắc ký đồ. [15]
Phương pháp này yêu cầu tất cả thành phần đều được rửa giải và được phát hiện.
Tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau.
Kỹ thuật này được sử dụng nhiều trong sắc ký khí vì thường có đáp ứng như nhau ở detector ion hóa ngọn lửa.
Trong khi đó lợi ích của kỹ thuật này trong HPLC bị hạn chế vì đáp ứng như nhau là đều thiếu chắc chắn.
Ví dụ: phân tích sắc ký một hỗn hợp ba thành phần X, Y, Z. Hàm lượng phần trăm của X được tính như sau
1 .100 .100 % x x n x y z i i S S X S S S S
Trong phương pháp trên nếu xét đến đáp ứng khác nhau của detector thì cần phải xác định hệ số đáp ứng đối với mỗi chất để hiệu chỉnh sự sai khác đó.
S (H)
Cx
Sx
Dung dịch thử thêm chuẩn
C chuẩn thêm vào
ĐỖ CAO VINH 32
Hệ số đáp ứng liên hệ với chất chuẩn theo công thức [15] . . . S x S x x S S C f F S C Ở đây
SS và Sx là diện tích của peak chuẩn và peak thử
CS và Cx là nồng độ của chất chuẩn và chất thử
fSlà hệ số hiệu chỉnh của chuẩn
Phương trình tính hàm lượng %X sẽ là [15] . .100 % X X X X Y Y Z Z S F X S F S F S F
Trong một số trường hợp có thể dùng phương pháp chuẩn hóa diện tích peak để định lượng các tạp chất trong thuốc.
2.9
ĐỖ CAO VINH 33
Chương 3 THỰC NGHIỆM