3.5.1 Khảo sát tính tuyến tính
Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak qua 8 mức nồng độ trong khoảng từ 25−400 ppm.
3.5.1.1 Cách tiến hành
Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị như sau: − Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
Hình 3.4: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc để khảo sát khoảng tuyến tính
− Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn gốc thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 300 ppm, 400 ppm. Thể tích dung dịch chuẩn gốc cần lấy để pha loãng và thể tích pha loãng được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Các dung dịch chuẩn xây dựng đường chuẩn
Vchuẩn gốc (mL) 5 1 2 3 4 5 3 10 Vbình (mL) 200 20 20 20 20 20 10 25 Cchuẩn (ppm) 25 50 100 150 200 250 300 400 Cân 55,7 mg ciprofloxacin hydrochloride chuẩn Dung dịch chuẩn gốc 1. Thêm 30 mL nước cất, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước cất đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Bình định mức 50 mL
ĐỖ CAO VINH 40
− Tiêm lần lượt các mẫu chuẩn vào hệ thống, xác định diện tích peak tương ứng với từng nồng độ. Xây dựng đường chuẩn đánh giá sự tuyến tính giữa đại lượng nồng độ và diện tích peak.
3.5.1.2Tính toán kết quả a) Phương trình hồi qui
Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b, với hệ số a và b
được xác định thông qua biểu thức sau:
2 2 ( ) x y xy n a x x n , b y ax Trong đó:
y là giá trị định lượng được
x là nồng độ định lượng
b) Hệ số tương quan
Hệ số tương quan được xác định qua biểu thức
2 2 ( ) ( ) ( ) ( ) x x y y R x x y y 3.5.1.3 Yêu cầu
Hệ số tương quan nằm trong khoảng 0,99R1 thì có sự tương quan tuyến tính.
3.5.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 3.5.2.1 Giới hạn phát hiện 3.5.2.1 Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu còn có thể phát hiện được, nhưng không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng.
3.2
ĐỖ CAO VINH 41
Giới hạn phát hiện có thể được xác định dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc : 3,3 SD LOD a Trong đó
a: Độ dốc của đường cong chuẩn độ.
SD: Độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
3.5.2.2 Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
Giới hạn định lượng có thể được xác định dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc: 10 SD LOQ a Trong đó
a: Độ dốc của đường cong chuẩn độ.
SD: Độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
3.5.3 Khảo sát độ đúng
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử để xác định tỉ lệ phục hồi. Lượng chuẩn thêm vào phải đảm bảo nồng độ định lượng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính, thường 10−20% nồng độ mẫu thử. Vì vậy, quy trình được tiến hành trên 3 nồng độ thêm chuẩn là 30 ppm (12%), 40 ppm (16%) và 50 ppm (20%).
3.5.3.1 Cách tiến hành
Mỗi nồng độ chuẩn được thêm vào 3 mẫu thử riêng biệt. Các dung dịch thêm chuẩn này được chuẩn bị như sau:
3.4
ĐỖ CAO VINH 42
− Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
Hình 3.5: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc để đánh giá độ đúng − Chuẩn bị dung dịch thử gốc
Hình 3.6: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch thử gốc để đánh giá độ đúng − Lấy một lượng dung dịch chuẩn gốc và dung dịch thử gốc cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng đến vạch; với thể tích của dung dịch thử gốc và dung dịch chuẩn gốc cần dùng được tiến hành theo Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Thể tích dung dịch chuẩn thêm vào 3 mẫu thử
Mẫu Vthử gốc (mL) Vchuẩn gốc (mL) Vbình (mL)
Thử + 30 ppm 10 3 100
Thử + 40 ppm 10 4 100
Thử + 50 ppm 10 5 100
3.5.3.2 Tính toán kết quả
Độ đúng của một phương pháp được thể hiện bằng tỷ lệ phục hồi, được tính toán qua công thức:
Cân 50 mg ciprofloxacin chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc
1. Thêm 30 mL nước, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước đến vạch, lắc đều. Bình định mức 50 mL Cân 390 mg bột thuốc Dung dịch thử gốc
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút.
2. Thêm nước đến vạch, lắc đều.
ĐỖ CAO VINH 43 TỶ LỆ PHỤC HỒI x 100 Trong đó:
x là hàm lượng chuẩn thêm vào tìm lại được. là lượng chuẩn thực tế cho vào.
3.5.3.3 Yêu cầu
Một qui trình định lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc đạt độ đúng cao khi tỉ lệ phục hồi nằm trong khoảng 98−102%.
3.5.4 Độ chính xác 3.5.4.1Cách tiến hành 3.5.4.1Cách tiến hành
Tiến hành định lượng ciprofloxacin trên 6 mẫu thử riêng biệt, tính chính xác được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả định lượng này.
Quy trình được thực hiện như sau:
− Chuẩn bị mẫu thử
Hình 3.7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch thử để đánh giá độ chính xác Cân 390 mg bột thuốc
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều, lọc. Bình định mức 100 mL Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 250 ppm theo nhãn 3.6
ĐỖ CAO VINH 44 3.5.4.2Tính toán kết quả
Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD), được xác định qua công thức:
2 ( ) ( 1) i x x SD n ; SD 100 RSD x Trong đó: xi là giá trị đo thứ i x là giá trị trung bình n là số lần đo 3.5.4.3Yêu cầu
Giá trị RSD của diện tích peak, thời gian lưu, phần trăm hàm lượng mẫu thử qua các lần đo nên 2,0%.
3.6 Định tính và định lượng trên mẫu 3.6.1 Định tính 3.6.1 Định tính
Dựa vào thời gian lưu của peak thử và peak chuẩn trên sắc ký đồ thu được từ kết quả định lượng.
Yêu cầu: Thời gian lưu của peak chính trên sắc ký đồ mẫu thử phải tương ứng với thời gian lưu của peak chính trên sắc ký đồ mẫu chuẩn.
3.6.2 Định lượng
Để đảm bảo xác định hàm lượng ciprofloxacin trong thuốc một cách chính xác và kết quả đáng tin cậy. Qui trình định lượng được tiến hành bằng phương pháp HPLC, sử dụng máy sắc ký lỏng HITACHI L−2000 với mẫu chuẩn và mẫu thử chuẩn bị theo chuyên luận định lượng ciprofloxacin viên nén trong Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33 và TCCS QC−STP−F018.
3.6.2.1Cách tiến hành
Các bước tiến hành xác định hàm lượng ciprofloxacin trong thuốc được thực hiện như sau:
− Chuẩn bị bột thuốc: Lấy 20 viên thành phẩm, loại bỏ lớp bao phim, cân xác định khối lượng trung bình viên nhân, nghiền thành bột mịn.
ĐỖ CAO VINH 45
− Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử theo Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33 và TCCS QC−STP−F018.
Theo Dược điển Việt Nam IV Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.8: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo Dược điển Việt Nam IV Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.9: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo Dược điển Việt Nam IV
Cân lượng bột thuốc khoảng 50 mg ciprofloxacin
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều, lọc. Bình định mức 100 mL Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 250 ppm theo nhãn Cân 25 mg ciprofloxacin chuẩn
Chuẩn nồng độ 250 ppm
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút.
2. Thêm nước đến vạch, lắc đều.
ĐỖ CAO VINH 46
Theo TCCS QC−STP−F018 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.10: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo TCCS QC−STP−F018 Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.11: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo TCCS QC−STP−F018 Cân 75 mg ciprofloxacin chuẩn
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL 1. Thêm 40 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 50 mL
Thêm dung môi pha loãng đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Chuẩn nồng độ 150 ppm
Cân lượng bột thuốc khoảng 75 mg ciprofloxacin
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL 1. Thêm 40 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 50 mL Thêm pha động đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 150 ppm theo nhãn
ĐỖ CAO VINH 47
Theo BP 2010
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo BP 2010 Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.13: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo BP 2010 Cân 40 mg ciprofloxacin chuẩn
Hút 3 mL, cho vào bình 50 mL 1. Thêm 40 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 50 mL Thêm pha động đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Chuẩn nồng độ 48 ppm Cân 715 mg bột thuốc Hút 5 mL, cho vào bình 200 mL 1. Thêm 150 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 250 mL Thêm pha động đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 50 ppm theo nhãn
ĐỖ CAO VINH 48
Theo USP 33
Chuẩn bị dung môi pha loãng: Dung dịch phosphoric acid 0,025 M (điều chỉnh đến pH 2,0 bằng triethylamine) và acetonitrile (87:13).
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.14: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo USP 33 Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.15: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo USP 33 Cân 40 mg ciprofloxacin chuẩn
Hút 5 mL, cho vào bình 25 mL
1. Thêm 40 mL dung môi pha loãng, siêu âm.
2. Thêm dung môi pha loãng đến vạch, lắc đều, lọc.
Bình định mức 50 mL
Thêm dung môi pha loãng đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Chuẩn nồng độ 160 ppm
Cân 2000 mg bột thuốc
Hút 1 mL, cho vào bình 25 mL
1. Thêm 150 mL dung môi pha loãng, siêu âm.
2. Thêm dung môi pha loãng đến vạch, lắc đều, lọc.
Bình định mức 250 mL
Thêm dung môi pha loãng đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 200 ppm theo nhãn
ĐỖ CAO VINH 49
− Chạy nền bằng pha động khoảng 30 phút. Sau khi ổn định, tiến hành tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống. Ghi lại tín hiệu diện tích peak, từ diện tích peak thử và chuẩn xác định nồng độ dung dịch thử và tính được hàm lượng thuốc trên viên.
3.6.2.2 Điều kiện sắc ký
Dựa vào yêu cầu Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33 và TCCS QC−STP−F018 và thông qua việc khảo sát các điều kiện phân tích để thu được tín hiệu peak tốt không bị kéo đuôi, hệ số đối xứng đạt yêu cầu. Các điều kiện tối ưu xây dựng được như sau:
Bảng 3.4 Điều kiện sắc ký của quy trình định lượng
Cột sắc ký Cột Restek Pinnacle II C18 (250 mm 4,6 mm, 5 m). Nhiệt độ cột 40C.
Pha động Dung dịch phosphoric acid 0,025 M (đã được điều chỉnh đến pH 3,0 bằng triethylamine) và acetonitrile (87:13) lọc qua màng lọc 0,45 m, đuổi khí.
Tốc độ dòng 1,5 mL/phút. Detector UV 278 nm. Thể tích tiêm 10−20 L
3.6.2.3 Tính toán kết quả
Công thức tính hàm lượng thuốc trên một viên (X) % 0,901 ( / ê ) t c t TB c t c S m P C m X mg vi n S m P Trong đó
Sc, St lần lượt là diện tích của peak chuẩn và thử.
mc, mtlần lượt là khối lượng của chuẩn và thử.
Pc, Pt lần lượt là hệ số pha loãng của chuẩn và thử.
C% là hàm lượng của chuẩn.
mTB là khối lượng trung bình của thuốc.
0,901 là hệ số quy đổi từ ciprofloxacin hydrochloride sang ciprofloxacin. 3.8
ĐỖ CAO VINH 50 3.6.2.4 Yêu cầu
Hiệu lực cột được xác định từ peak chính trên sắc ký đồ, có số đĩa lý thuyết không được dưới 2500, hệ số đối xứng không lớn hơn 2 và RSD của 6 lần tiêm nhắc lại của dung dịch chuẩn không lớn hơn 1,5%.
Hàm lượng ciprofloxacin (C17H18FN3O3) từ 95,0 đến 105,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn.
ĐỖ CAO VINH 51
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Các yêu cầu của dạng thuốc 4.1.1 Đánh giá cảm quan 4.1.1 Đánh giá cảm quan
4.1.1.1 Kết quả
Tiến hành quan sát hình dạng, màu sắc và kiểm tra thành, cạnh viên của 8 mẫu thuốc, thu được kết quả như sau:
Bảng 4.1: Kết quả đánh giá cảm quan
Mẫu Hình dạng
1, 2, 3 Viên nén dài bao phim màu trắng, hai mặt viên trơn, cạnh và thành viên lành lặn.
4, 5, 6 Viên nén bao phim màu trắng, dạng oval, một mặt có chữ “SCAN”, một mặt trơn, thành và cạnh viên lành lặn.
7 Viên nén dài màu trắng, hai mặt trơn, thành và cạnh viên lành lặn. 8 Viên nén màu trắng, một mặt có vạch ngang, một mặt trơn, thành và
cạnh viên lành lặn.
4.1.1.2 Kết luận
Tất cả các mẫu thuốc điều đạt yêu cầu về hình dạng, màu sắc và các chữ, kí hiệu đúng như đăng kí của nhà sản xuất. Các viên thuốc vẫn còn nguyên vẹn, thành và cạnh lành lặn, không bị gãy vỡ, bở vụn trong quá trình vận chuyển, bảo quản.
4.1.2 Độ đồng đều khối lượng 4.1.2.1 Kết quả 4.1.2.1 Kết quả
Tiến hành cân ngẫu nhiên 20 viên ở mỗi mẫu, kết quả khối lượng viên thấp nhất, khối lượng viên cao nhất và khoảng giới hạn được trình bày như sau:
ĐỖ CAO VINH 52
Bảng 4.2: Kết quả độ đồng đều khối lượng
Mẫu m (mg) mtb (mg) mmin (mg) mmax (mg) Giới hạn (mg)
1 15678,0 783,9 760 801 744,7823,1 2 15614,1 780,7 769 795 741,7819,7 3 15656,3 782,8 765 798 743,7821,9 4 15930,9 796,5 781 807 756,7836,3 5 15713,6 785,7 771 806 746,4825,0 6 15784,8 789,2 776 811 749,7828,7 7 14262,6 713,1 699 720 677,4748,8 8 16051,7 802,6 788 816 762,5842,7
Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn khối lượng của viên nhỏ nhất và lớn nhất so với khoảng giới hạn qui định
4.1.2.2 Kết luận
Kết quả khảo sát ở Bảng 4.2 và Hình 4.1 cho thấy khối lượng của viên lớn nhất và viên nhỏ nhất trong 20 viên ở 8 mẫu khảo sát đều nằm trong khoảng 95−105% so với khối lượng trung bình. Như vậy, tất cả các mẫu đều đạt yêu cầu độ đồng đều khối lượng theo qui định Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33. 102,181 101,832 101,942 101,318 102,584 102,762 100,968 101,670 96,951 95,501 97,726 98,054 98,129 98,327 98,023 98,181 90 92 94 96 98 100 102 104 106 1 2 3 4 5 6 7 8
KẾT QUẢ ĐỘ ĐỒNG ĐỀU KHỐI LƯỢNG
khối lượng viên lớn nhất so với trung bình khối lượng viên nhỏ nhất so với trung bình giới hạn dưới
giới hạn trên %
ĐỖ CAO VINH 53 4.1.3 Độ hòa tan
4.1.3.1 Kết quả
Tiến hành đánh giá độ hòa tan 8 mẫu, mỗi mẫu 6 viên. Kết quả viên có phầm trăm phóng thích cực tiểu (Qmin) và cực đại (Qmax) được trình bày như sau:
Bảng 4.3: Kết quả độ hòa tan
Mẫu Absmin Absmax Qmin (%) Qmax (%)
1 0,6064 0,6385 90,6 95,4 2 0,6015 0,6567 89,9 98,2 3 0,6080 0,6421 90,9 96,0 4 0,6873 0,7334 97,6 104,2 5 0,7055 0,7347 97,7 101,7 6 0,7080 0,7260 98,0 102,5 7 0,6155 0,6422 87,2 91,0 8 0,6909 0,7074 97,5 99,8
Hình 4.2: Biểu đồ hàm lượng viên phóng thích cực đại và cực tiểu so với yêu cầu hàm lượng phóng thích
4.1.3.2 Kết luận
Qua kết quả thực nghiệm thu được trong Bảng 4.3 và Hình 4.2 cho thấy hàm lượng hoạt chất phóng thích ra môi trường của 6 viên trong mỗi mẫu đều
95,4 98,2 96,0 104,2 101,7 102,5 91,0 99,8 90,6 89,9 90,9 97,6 97,7 98,0 87,2 97,5 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8
KẾT QUẢ ĐỘ HÒA TAN
Hàm lượng phóng thích cao nhất Hàm lượng phóng tích thấp nhất Yêu cầu hàm lượng phóng thích %
ĐỖ CAO VINH 54
lớn hơn 80%. Như vậy, độ hòa tan của 8 mẫu khảo sát đều đạt yêu cầu theo qui định trong Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33.
4.2 Thẩm định qui trình định lượng 4.2.1 Khoảng tuyến tính 4.2.1 Khoảng tuyến tính
4.2.1.1 Kết quả
Tiêm lần lượt 8 mẫu chuẩn vào hệ thống, với mỗi nồng độ thu được