Theo mục tiêu đặt ra, đề tài tiến hành thực hiện các thí nghiệm sau: 1. Đánh giá các yêu cầu chất lượng của dạng thuốc.
− Nhận xét cảm quan.
− Kiểm tra độ đồng đều khối lượng. − Thử độ hòa tan.
2. Thẩm định quy trình định lượng hoạt chất trong mẫu thuốc, gồm các tiêu chí sau:
− Tính tuyến tính.
− Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện. − Độ thu hồi.
− Độ chính xác.
3. Định tính và tiến hành định lượng hoạt chất trong mẫu thuốc theo quy trình đã thẩm định.
ĐỖ CAO VINH 36
3.4 Các yêu cầu chất lượng của dạng thuốc 3.4.1 Đánh giá cảm quan
3.4.1.1 Cách tiến hành
Quan sát hình dạng, màu sắc, các chữ hoặc kí hiệu trên bề mặt viên và đánh giá cạnh, thành viên bằng mắt.
3.4.1.2 Yêu cầu
Hình dạng, màu sắc, kí hiệu đúng như mô tả của nhà sản xuất. Thành và cạnh viên lành lặn, không sứt mẻ, gãy vụn.
3.4.2 Xác định độ đồng đều về khối lượng
Độ đồng đều khối lượng là một chỉ tiêu thể hiện tính đồng nhất về hình thức trong sản xuất, chỉ tiêu này còn ảnh hưởng trực tiếp đến sai số về hàm lượng. Độ đồng đều khối lượng được xác định thông qua độ lệch khối lượng của 20 viên thuốc so với khối lượng trung bình, giá trị này phải nằm trong giới hạn qui định.
3.4.2.1 Cách tiến hành
Để xác định chỉ tiêu độ đồng đều khối lượng, thực hiện theo các bước sau:
− Dùng cân phân tích cân chính xác khối lượng 20 viên bất kỳ trong một lô và xác định khối lượng trung bình viên.
− Từ khối lượng trung bình viên và độ lệch khối lượng theo quy định trong Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33 tính được khoảng giới hạn.
− Cân riêng khối lượng từng viên và so sánh với khoảng giới hạn. − Tiến hành lần lượt cho đến khi hết 8 mẫu khảo sát.
− Chú ý: Sau khi đặt thuốc lên giá cân phải đợi đến khi nào có một biểu tượng hình tròn hiện lên bên gốc trái của màn hình rồi đọc kết quả.
3.4.2.2 Yêu cầu
Lô thuốc đạt yêu cầu nếu không có quá 2 viên có độ lệch ngoài 5% so với khối lượng trung bình, nhưng không được có viên nào lệch quá 10%.
ĐỖ CAO VINH 37 3.4.3 Đánh giá độ hòa tan
Chỉ tiêu độ hòa tan được đánh giá thông qua hàm lượng hoạt chất phóng thích vào môi trường sau khoảng thời gian quy định, để tính được giá trị này tiến hành đo độ hấp thu của dịch hòa tan ở bước sóng xác định. Độ hòa tan đạt yêu cầu khi cả 6 viên đem thử đều có hàm lượng phóng thích đạt yêu cầu.
3.4.3.1 Cách tiến hành
Để kiểm tra khả năng hòa tan của các mẫu khảo sát, tiến hành theo trình tự như sau:
− Lắp 6 cốc vào bể điều nhiệt của hệ thống. Sau đó đong chính xác 900 mL môi trường hòa tan cho vào mỗi cốc, lắp thiết bị cách khuấy vào trục quay.
− Hạ hệ thống cánh khuấy vào các cốc sao cho đúng vị trí như quy định, điều chỉnh tốc độ khuấy, nhiệt độ và thời gian theo yêu cầu tiêu chuẩn.
− Đợi đến khi nhiệt độ trong 6 cốc ổn định 36,537,5C, cho 6 viên thuốc lần lượt vào 6 cốc hòa tan và cho hệ thống khuấy hoạt động.
− Đến thời gian quy định lấy một phần dung dịch hòa tan từ 6 cốc, lọc vào 6 bình nón, tráng bỏ 20 mL dung dịch đầu. Pha loãng 100 lần bằng môi trường hòa tan. Đo độ hấp thu của từng dung dịch ở bước sóng 276 nm.
− Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Hình 3.2: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch chuẩn cho độ hòa tan Cân 25 mg ciprofloxacin chuẩn
Hút 1 mL, cho vào bình100 mL
1. Thêm 30 mL môi trường hòa tan, siêu âm.
2. Thêm môi trường hòa tan đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Bình định mức 50 mL
100 mL dung dịch chuẩn
Thêm môi trường hòa tan đến vạch, đậy nắp, lắc đều.
ĐỖ CAO VINH 38
− Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.3: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch thử cho độ hòa tan
3.4.3.2 Điều kiện hòa tan
Thiết bị: kiểu cánh khuấy.
Tốc độ quay: 50 vòng/phút. Thời gian: 30 phút. Môi trường: − Nước cất: Mẫu 1, 2, 3, 7. − Dung dịch HCl 0,01 N: Mẫu 4, 5, 6, 8. 3.4.3.3 Tính toán kết quả
Phần trăm hoạt chất giải phóng vào môi trường được tính toán thông qua biểu thức sau:
% 0,901 100% t c t c t c A m P C Q A m P Trong đó:
Ac, Atlần lượt là độ hấp thu của chuẩn và thử;
mc, mtlần lượt là khối lượng của chuẩn và thử;
Pc, Pt lần lượt là hệ số pha loãng của chuẩn và thử; %C là hàm lượng phần trăm của chất chuẩn;
0,901 là hệ số quy đổi từ ciprofloxacin hydrochloride sang ciprofloxacin. Hút 1 mL dịch lọc từ môi trường hòa tan
100 mL dung dịch thử
Thêm môi trường hòa tan đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Bình định mức 100 mL
ĐỖ CAO VINH 39 3.4.3.4 Yêu cầu
Không được ít hơn 80% ciprofloxacin C17H18FN3O3 so với lượng ghi trên nhãn được hòa tan sau 30 phút.
3.5 Thẩm định quy trình định lượng 3.5.1 Khảo sát tính tuyến tính 3.5.1 Khảo sát tính tuyến tính
Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak qua 8 mức nồng độ trong khoảng từ 25−400 ppm.
3.5.1.1 Cách tiến hành
Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị như sau: − Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
Hình 3.4: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc để khảo sát khoảng tuyến tính
− Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn gốc thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm, 300 ppm, 400 ppm. Thể tích dung dịch chuẩn gốc cần lấy để pha loãng và thể tích pha loãng được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Các dung dịch chuẩn xây dựng đường chuẩn
Vchuẩn gốc (mL) 5 1 2 3 4 5 3 10 Vbình (mL) 200 20 20 20 20 20 10 25 Cchuẩn (ppm) 25 50 100 150 200 250 300 400 Cân 55,7 mg ciprofloxacin hydrochloride chuẩn Dung dịch chuẩn gốc 1. Thêm 30 mL nước cất, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước cất đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Bình định mức 50 mL
ĐỖ CAO VINH 40
− Tiêm lần lượt các mẫu chuẩn vào hệ thống, xác định diện tích peak tương ứng với từng nồng độ. Xây dựng đường chuẩn đánh giá sự tuyến tính giữa đại lượng nồng độ và diện tích peak.
3.5.1.2Tính toán kết quả a) Phương trình hồi qui
Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b, với hệ số a và b
được xác định thông qua biểu thức sau:
2 2 ( ) x y xy n a x x n , b y ax Trong đó:
y là giá trị định lượng được
x là nồng độ định lượng
b) Hệ số tương quan
Hệ số tương quan được xác định qua biểu thức
2 2 ( ) ( ) ( ) ( ) x x y y R x x y y 3.5.1.3 Yêu cầu
Hệ số tương quan nằm trong khoảng 0,99R1 thì có sự tương quan tuyến tính.
3.5.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 3.5.2.1 Giới hạn phát hiện 3.5.2.1 Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu còn có thể phát hiện được, nhưng không nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng.
3.2
ĐỖ CAO VINH 41
Giới hạn phát hiện có thể được xác định dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc : 3,3 SD LOD a Trong đó
a: Độ dốc của đường cong chuẩn độ.
SD: Độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
3.5.2.2 Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
Giới hạn định lượng có thể được xác định dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc: 10 SD LOQ a Trong đó
a: Độ dốc của đường cong chuẩn độ.
SD: Độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
3.5.3 Khảo sát độ đúng
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử để xác định tỉ lệ phục hồi. Lượng chuẩn thêm vào phải đảm bảo nồng độ định lượng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính, thường 10−20% nồng độ mẫu thử. Vì vậy, quy trình được tiến hành trên 3 nồng độ thêm chuẩn là 30 ppm (12%), 40 ppm (16%) và 50 ppm (20%).
3.5.3.1 Cách tiến hành
Mỗi nồng độ chuẩn được thêm vào 3 mẫu thử riêng biệt. Các dung dịch thêm chuẩn này được chuẩn bị như sau:
3.4
ĐỖ CAO VINH 42
− Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
Hình 3.5: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc để đánh giá độ đúng − Chuẩn bị dung dịch thử gốc
Hình 3.6: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch thử gốc để đánh giá độ đúng − Lấy một lượng dung dịch chuẩn gốc và dung dịch thử gốc cho vào bình định mức 100 mL, pha loãng đến vạch; với thể tích của dung dịch thử gốc và dung dịch chuẩn gốc cần dùng được tiến hành theo Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Thể tích dung dịch chuẩn thêm vào 3 mẫu thử
Mẫu Vthử gốc (mL) Vchuẩn gốc (mL) Vbình (mL)
Thử + 30 ppm 10 3 100
Thử + 40 ppm 10 4 100
Thử + 50 ppm 10 5 100
3.5.3.2 Tính toán kết quả
Độ đúng của một phương pháp được thể hiện bằng tỷ lệ phục hồi, được tính toán qua công thức:
Cân 50 mg ciprofloxacin chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc
1. Thêm 30 mL nước, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước đến vạch, lắc đều. Bình định mức 50 mL Cân 390 mg bột thuốc Dung dịch thử gốc
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút.
2. Thêm nước đến vạch, lắc đều.
ĐỖ CAO VINH 43 TỶ LỆ PHỤC HỒI x 100 Trong đó:
x là hàm lượng chuẩn thêm vào tìm lại được. là lượng chuẩn thực tế cho vào.
3.5.3.3 Yêu cầu
Một qui trình định lượng hoạt chất trong các chế phẩm thuốc đạt độ đúng cao khi tỉ lệ phục hồi nằm trong khoảng 98−102%.
3.5.4 Độ chính xác 3.5.4.1Cách tiến hành 3.5.4.1Cách tiến hành
Tiến hành định lượng ciprofloxacin trên 6 mẫu thử riêng biệt, tính chính xác được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả định lượng này.
Quy trình được thực hiện như sau:
− Chuẩn bị mẫu thử
Hình 3.7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch thử để đánh giá độ chính xác Cân 390 mg bột thuốc
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều, lọc. Bình định mức 100 mL Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 250 ppm theo nhãn 3.6
ĐỖ CAO VINH 44 3.5.4.2Tính toán kết quả
Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD), được xác định qua công thức:
2 ( ) ( 1) i x x SD n ; SD 100 RSD x Trong đó: xi là giá trị đo thứ i x là giá trị trung bình n là số lần đo 3.5.4.3Yêu cầu
Giá trị RSD của diện tích peak, thời gian lưu, phần trăm hàm lượng mẫu thử qua các lần đo nên 2,0%.
3.6 Định tính và định lượng trên mẫu 3.6.1 Định tính 3.6.1 Định tính
Dựa vào thời gian lưu của peak thử và peak chuẩn trên sắc ký đồ thu được từ kết quả định lượng.
Yêu cầu: Thời gian lưu của peak chính trên sắc ký đồ mẫu thử phải tương ứng với thời gian lưu của peak chính trên sắc ký đồ mẫu chuẩn.
3.6.2 Định lượng
Để đảm bảo xác định hàm lượng ciprofloxacin trong thuốc một cách chính xác và kết quả đáng tin cậy. Qui trình định lượng được tiến hành bằng phương pháp HPLC, sử dụng máy sắc ký lỏng HITACHI L−2000 với mẫu chuẩn và mẫu thử chuẩn bị theo chuyên luận định lượng ciprofloxacin viên nén trong Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33 và TCCS QC−STP−F018.
3.6.2.1Cách tiến hành
Các bước tiến hành xác định hàm lượng ciprofloxacin trong thuốc được thực hiện như sau:
− Chuẩn bị bột thuốc: Lấy 20 viên thành phẩm, loại bỏ lớp bao phim, cân xác định khối lượng trung bình viên nhân, nghiền thành bột mịn.
ĐỖ CAO VINH 45
− Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử theo Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33 và TCCS QC−STP−F018.
Theo Dược điển Việt Nam IV Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.8: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo Dược điển Việt Nam IV Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.9: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo Dược điển Việt Nam IV
Cân lượng bột thuốc khoảng 50 mg ciprofloxacin
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút. 2. Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều, lọc. Bình định mức 100 mL Thêm nước đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 250 ppm theo nhãn Cân 25 mg ciprofloxacin chuẩn
Chuẩn nồng độ 250 ppm
1. Thêm 60 mL nước, siêu âm 20 phút.
2. Thêm nước đến vạch, lắc đều.
ĐỖ CAO VINH 46
Theo TCCS QC−STP−F018 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.10: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo TCCS QC−STP−F018 Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.11: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo TCCS QC−STP−F018 Cân 75 mg ciprofloxacin chuẩn
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL 1. Thêm 40 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 50 mL
Thêm dung môi pha loãng đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Chuẩn nồng độ 150 ppm
Cân lượng bột thuốc khoảng 75 mg ciprofloxacin
Hút 5 mL, cho vào bình 50 mL 1. Thêm 40 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 50 mL Thêm pha động đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 150 ppm theo nhãn
ĐỖ CAO VINH 47
Theo BP 2010
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.12: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo BP 2010 Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.13: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo BP 2010 Cân 40 mg ciprofloxacin chuẩn
Hút 3 mL, cho vào bình 50 mL 1. Thêm 40 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 50 mL Thêm pha động đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Chuẩn nồng độ 48 ppm Cân 715 mg bột thuốc Hút 5 mL, cho vào bình 200 mL 1. Thêm 150 mL pha động, siêu âm. 2. Thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc. Bình định mức 250 mL Thêm pha động đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 50 ppm theo nhãn
ĐỖ CAO VINH 48
Theo USP 33
Chuẩn bị dung môi pha loãng: Dung dịch phosphoric acid 0,025 M (điều chỉnh đến pH 2,0 bằng triethylamine) và acetonitrile (87:13).
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Hình 3.14: Sơ đồ chuẩn bị mẫu chuẩn theo USP 33 Chuẩn bị dung dịch thử
Hình 3.15: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử theo USP 33 Cân 40 mg ciprofloxacin chuẩn
Hút 5 mL, cho vào bình 25 mL
1. Thêm 40 mL dung môi pha loãng, siêu âm.
2. Thêm dung môi pha loãng đến vạch, lắc đều, lọc.
Bình định mức 50 mL
Thêm dung môi pha loãng đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Chuẩn nồng độ 160 ppm
Cân 2000 mg bột thuốc
Hút 1 mL, cho vào bình 25 mL
1. Thêm 150 mL dung môi pha loãng, siêu âm.
2. Thêm dung môi pha loãng đến vạch, lắc đều, lọc.
Bình định mức 250 mL
Thêm dung môi pha loãng đến vạch, đậy nắp, lắc đều. Mẫu thử 200 ppm theo nhãn
ĐỖ CAO VINH 49
− Chạy nền bằng pha động khoảng 30 phút. Sau khi ổn định, tiến hành tiêm lần lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống. Ghi lại tín hiệu diện tích peak, từ diện tích peak thử và chuẩn xác định nồng độ dung dịch thử và tính được hàm lượng thuốc trên viên.
3.6.2.2 Điều kiện sắc ký
Dựa vào yêu cầu Dược điển Việt Nam IV, BP 2010, USP 33 và TCCS QC−STP−F018 và thông qua việc khảo sát các điều kiện phân tích để thu