3.4.2.1. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn
Eczema là bệnh do nhiều yếu tố nội ngoại sinh kết hợp gây nên. Trong đó không thể không kể đến eczema thứ phát do nhiễm khuẩn, nhiễm nội độc tố của các vi khuẩn kí sinh trên da. Nhƣ vậy, một bài thuốc có tác dụng điều trị eczema tốt cần loại bỏ đƣợc yếu tố nội độc tố vi khuẩn - một trong những dị nguyên hay gặp gây eczema thứ phát [5].
Theo các nghiên cứu trƣớc đây, các dịch chiết từng thành phần của bài thuốc ở những dung môi khác nhau đều cho thấy khả năng ức chế nhất định với một số vi khuẩn Gr (+) và Gr (-): Nƣớc sắc lá kim ngân đằng có tác dụng ức chế vi trùng lỵ Shiga, vi trùng phó thƣơng hàn A, tụ cầu khuẩn tùy thuộc vào nồng độ [18], [31] nhờ thành phần acid 3,5-dio-caffeoyl-quinic, 4,5-dio-caffeoylquinic acid [56].
Dịch chiết dichloromethane vỏ thân và rễ núc nác ức chế các chủng vi khuẩn Gr (+) (B. subtilis, S. aureus), Gr (-) (E. coli, P. aeruginosa) và nấm C. albicans
[42].
Thƣơng nhĩ tử có tác dụng kháng nhiều chủng vi khuẩn nhờ thành phần xanthinin và xanthium trong dịch chiết ethanol [18].
Dịch chiết ethanol hoàng bá có tác dụng kháng với nhiều loại vi khuẩn Gram (+) và (-) (Staphyllococus, lỵ, thổ tả, Salmonella) [18], [23].
Đơn lá đỏ đƣợc chứng minh có khả năng ức chế nhiều chủng vi khuẩn Gr (+) và một vài chủng Gr (-) tùy thuộc dạng chiết xuất [2].
Nhƣ vậy, nhiều khả năng cao bài thuốc sẽ có tác dụng ức chế vi khuẩn tốt. Theo kết quả nghiên cứu bài thuốc, cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol đều có tác dụng ức chế trên các chủng vi khuẩn Gr (+) và Gr (-), trong đó cao chiết ethanol luôn ức chế tốt hơn. Điều này là phù hợp với những nghiên cứu trƣớc đây về dịch chiết đơn lá đỏ và dịch chiết thƣơng nhĩ tử bằng ethanol có tác dụng kháng khuẩn, trong khi dịch chiết nƣớc của thƣơng nhĩ tử thì không có tác dụng này.
Tuy nhiên, trong khi dịch chiết xanthium của thƣơng nhĩ tử có tác dụng ức chế mạnh trên các chủng Gr (-) thì cao bài thuốc lại không có phổ rộng trên các chủng này. Có thể lý giải do nồng độ thử khá thấp trong khi tỷ lệ thƣơng nhĩ tử trong bài thuốc lại không cao.
Hai mẫu cao đều chỉ ức chế đƣợc 5 chủng Gr (+) và Gr (-) với SD >1, nhƣ vậy khả năng ức chế vi khuẩn là chƣa ổn định, liên tục, cần nghiên cứu thêm.
3.4.2.2. Độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp là một nghiên cứu quan trọng khi phát triển một bài thuốc mới. Khảo sát độc tính cấp là đánh giá những biểu hiện bất thƣờng xuất hiện do thuốc gây ra sau khi dùng 1 liều duy nhất hoặc trong 24 giờ đầu tiên trên súc vật [36].
Nghiên cứu độc tính cấp giúp xem xét khoảng cách giữa liều độc và liều tác dụng để xác định phạm vi an toàn của thuốc, đồng thời xác định đƣợc LD50 từ đó có thể chọn liều thử tác dụng ED50 [36].
Phƣơng pháp nghiên cứu Litchfield-Wilcoson là phƣơng pháp đƣợc chứng minh có tác dụng nghiên cứu độc tính cấp tốt nhất, cho kết quả tốt nhất tuy nhiên lại rất tốn súc vật thí nghiệm.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hòe hoa và kim ngân đằng không có độc tính [18], [30], [31]: Khi tăng liều gấp hàng trăm lần liều sử dụng ở ngƣời, các chuột thử nghiệm vẫn sống bình thƣờng, giải phẫu các cơ quan không có dấu hiệu bất thƣờng.
Theo Nguyễn Thái An (1999), khi sử dung dịch sắc lá đơn lá đỏ khô và tƣơi trên chuột nhắt trắng, sau 72 giờ, tất cả các lô chuột vẫn sống, không có biểu hiện nhiễm độc. Nhƣ vậy đơn lá đỏ không có độc tính [2].
Núc nác đƣợc chứng minh độc tính rất thấp, LD50 đối với chuột nhắt trắng là 23ml dịch chiết vỏ núc nác 100% trên 1 kg TT [18], [31].
Tuy nhiên, hoàng bá lại có độc tính tƣơng đối trên chuột trắng khi tiêm phúc mạc: LD50=2,7g/kg [18], [30].
Thƣơng nhĩ tử có độc tính, gây tổn thƣơng tế bào gan cấp tính [18], [52]. Nhƣ vậy, bài thuốc nghiên cứu có khả năng gây độc tính cấp trên đối tƣợng sử dụng.
Kết quả thực nghiệm cho thấy cả hai cao thuốc đều có độc tính nhất định, cao sắc nƣớc có độc tính cao hơn cao chiết ethanol. Cao chiết ethanol có độc tính thấp hơn (mô hình này giải thích đƣợc 96% sự biến thiên của biến), điều này đƣợc lý giải do quá trình loại tạp phức tạp hơn giúp loại tạp tốt hơn, tránh ảnh hƣởng của các tạp (đặc biệt là chất nhựa) lên đối tƣợng sử dụng thuốc.
Từ kết quả này, có thể tính đƣợc mức an toàn của thuốc qua chỉ số trị liệu (TI): TI cao sắc nƣớc=LD50/liều dùng= 17,88, nằm trong khoảng 10-20, nhƣ vậy, cao sắc nƣớc đƣợc cho là tƣơng đối an toàn.
TI cao chiết ethanol=LD50/liều dùng= 29,25, > 20, nhƣ vậy, cao chiết ethanol rất an toàn.
Có thể kết luận, cả cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol đều có mức độ an toàn cao, có thể ứng dụng tốt trên lâm sàng.
3.4.2.3. Khảo sát tác dụng chống viêm cấp theo phương pháp gây viêm tai chuột nhắt
Mô hình gây viêm tai chuột nhắt bằng dầu croton đƣợc Tubaro và cs. đƣa ra vào năm 1985 [33]. Sau đó, mô hình này đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng để đánh giá tác dụng chống viêm của các thuốc hoặc dƣợc chất [34], [39], [47].
Dầu croton là một sản phẩm lấy từ hạt của cây ba đậu (Croton tiglium), thuộc họ Thầu Dầu, một loài thực vật bản địa và hay đƣợc trồng ở Ấn Độ. Dầu croton có tính tẩy mạnh, có thể gây tiêu chảy khi dùng đƣờng uống. Khi dùng ngoài da, dầu croton gây kích ứng mạnh do hoạt chất chính phorbol [45]. Do có hoạt tính kích ứng ngoài da mạnh nên dầu croton đƣợc sử dụng để nghiên cứu các chất chống viêm, giảm đau.
Cơ chế kích ứng da của dầu croton đƣợc giải thích thông qua Phospholipase A2 (PLA2). Dầu croton làm tăng hoạt tính của PLA2 dẫn tới tăng tạo acid arachidonic và sau đó là các yếu tố liên quan tới quá trình viêm nhƣ leucotrien và prostagladin. Cơ chế gây kích ứng da của dầu croton có sự tham gia hoạt hóa của hai hệ enzym là Cyclooxygenase (COX) và Lipooxigenase (LOX) [35], [44].
Theo những nghiên cứu trƣớc đây, kim ngân đằng đƣợc cho là có khả năng ức chế phản ứng viêm của cơ thể một phần đƣợc thể hiện ở việc nhiều tác giả thƣờng sử dụng kim ngân đằng thay thế kim ngân hoa (vị dƣợc liệu đã đƣợc chứng minh khả năng chống viêm) trong nhiều bài thuốc chữa mụn nhọt lở loét [18].
Dịch chiết n-butanol có tác dụng chống viêm trên mô hình viêm tai gây bằng croton nhờ thành phần caffeoylquinic và ba heterocyclics [40].
Rutin và quercetin trong hòe hoa có tác dụng chống viêm: Quercetin và rutin có tác dụng chống viêm trên chuột và trên thỏ, rutin tiêm tĩnh mạch có tác dụng phòng ngừa viêm da dị ứng và hiện tƣợng Arthus [18]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Núc nác có khả năng ức chế GD viêm cấp tính khi có hoặc không có đáp ứng của tuyến thƣợng thận tuy nhiên chỉ thể hiện tốt trên những động vật đã đƣợc mẫn cảm hóa [18], [31].
Dịch chiết ethanol của hoàng bá có tác dụng chống viêm tiềm năng do làm giảm mức độ phù tai ở chuột gây viêm tai bằng 1 loại phorbol (TPA) [54].
Kết quả thực nghiệm cho thấy cả cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol đều có xu hƣớng ức chế viêm trên mô hình gây viêm tai chuột nhắt trắng tuy nhiên chƣa có dấu hiệu phụ thuộc vào liều và không có ý nghĩa thống kê. Điều này có thể lý giải do bản thân mô hình gây viêm tai chuột nhắt là mô hình thƣờng đƣợc áp dụng để đánh giá các dạng thuốc bôi chống viêm tại chỗ hơn thuốc dùng đƣờng toàn thân; bên cạnh đó, động vật thí nghiệm chƣa đƣợc mẫn cảm hóa, hoặc do các bƣớc loại tạp còn đơn giản nên cao chiết ethanol và cao sắc nƣớc đều còn một lƣợng tạp chất nhất định gây cản trở tác dụng dƣợc lý của cao.
3.4.2.4. Khảo sát tác dụng chống viêm cấp theo phương pháp gây phù chân ở chuột
Mô hình gây viêm cấp bằng carrageenin đƣợc Winter và cs. mô tử và áp dụng lần đầu tiên vào năm 1962. Ban đầu, đây là mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của indomethacin, nhƣng cho đến nay, mô hình này vẫn là mô hình kinh điển thử tác dụng chống viêm cấp [32].
Carrageenin có bản chất là sulfopolygalactosid - một polysaccharid, đƣợc chế tạo từ loài tảo đỏ Chondrus crispus. Carrageenin tan đƣợc trong nƣớc, khi pha thành dung dịch 1% trong NaCl 0.9% thì thu đƣợc dung dịch đồng nhất thuận lợi cho việc phân liều. Polysaccharid là một chất đóng vai trò quan trọng trong cơ chế viêm cấp tính. Tuy nhiên để có thể sinh kháng thể với carrageenin cần đƣa vào cơ thể chuột dƣới dạng tiêm dƣới da với lƣợng ít. Sau khi tiêm, độ phù chân chuột đạt giá trị lớn nhất vào thời điểm 4 giờ [32].
Các nhà khoa học Hàn Quốc đã chỉ ra dịch chiết nƣớc của Lonicera japonica
có tác dụng lên thụ thể PAR2 gây phù ở chuột ở liều 50, 100 và 200 mg/kg cho tác dụng ức chế phù chân chuột rõ rệt [57].
Quercetin và rutin trong hòe có tác dụng ức chế phù bàn chân trên chuột và trên thỏ [18].
Theo Nguyễn Thái An (2003), dịch sắc lá đơn lá đỏ có tác dụng làm giảm phù ngay từ giờ thứ 3 trở đi và kéo dài tới tận 24 giờ, thậm chí 30 giờ. Tác dụng chống viêm của dịch sắc đơn lá đỏ yếu hơn và xuất hiện chậm hơn tác dụng của aspirin nhƣng tác dụng lại kéo dài hơn [1].
β-sitosterol-β-D-glucosid trong thƣơng nhĩ tử đã đƣợc chứng minh có tác dụng chống viêm, giảm phù trên động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng [18].
Theo Nguyễn Hoàng Hải (2001), dịch chiết ethanol của vỏ thân núc nác có tỷ lệ ức chế phù lên đến 50.7% [11]. Dịch chiết dichloromethane vỏ thân và rễ núc nác cũng cho thấy có tác dụng chống viêm trên phù chân chuột [42].
Tuy chƣa có báo cáo, bài báo về thực nghiệm tác dụng ức chế phù gây bằng carrageenin trên chuột của hoàng bá, nhƣng những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng hoàng bá là vị dƣợc liệu có tiềm năng sử dụng điều trị các chứng mẩn ngứa, phù nề [52].
Kết quả thí nghiệm cho thấy, cao chiết ethanol và cao sắc nƣớc liều tƣơng đƣơng lâm sàng đều có tác dụng làm giảm phù chân chuột tại thời điểm 4h, 6h và 24h, tác dụng giảm phù rõ rệt vào thời điểm 4h và 6h (tƣơng đƣơng tác dụng của aspirin) và có kéo dài tới 24h tuy nhiên tác dụng giảm phù đã giảm đi rõ rệt. Điều này phù hợp với tiến trình giảm phù của đơn lá đỏ.
Cao chiết ethanol liều cao cho thấy tác dụng giảm phù tốt hơn liều thấp, và tác dụng tƣơng đƣơng tác dụng giảm phù của núc nác tại thời điểm 6h, trong khi đó, cao sắc nƣớc liều cao lại lại không có tác dụng làm giảm phù trong thực nghiệm này. Nhƣ vậy, có thể thấy với cao chiết ethanol, khi tăng liều, tác dụng ức chế phù có tăng, ngƣợc lại có thể khẳng định tác dụng giảm phù của cao sắc nƣớc không phụ thuộc vào liều.
Hai thí nghiệm trên mô hình nghiên cứu chống viêm cấp là những thí nghiệm cần thiết để khảo sát tác dụng của một vị thuốc hay bài thuốc có khả năng ức chế các phản ứng viêm cấp tính [39], [46], kết quả đã cho thấy tác dụng chống viêm cấp của cao chiết ethanol tốt hơn cao sắc nƣớc và có phụ thuộc vào liều.
Mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amiant đƣợc Meier và cs. mô tả, áp dụng từ năm 1950 và đƣợc Ducrot, Julou phát triển hoàn thiện.
Nguyên tắc: Muốn gây viêm mạn trên chuột, cần đƣa vào cơ thể kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức, cấu trúc phức tạp và gắn với protein trong cơ thể. Các tác nhân gây viêm trơ nhƣ bông, amiant… không có khả năng tiêu đi bởi quá trình viêm, cơ thể phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào xung quanh dị vật và tạo thành u hạt. Về mặt tổ chức học, u hạt là nơi tập trung của nhiều loại tế bào nhƣ bạch cầu, đại thực bào, tế bào dạng biểu mô, tế bào khổng lồ, tế bào lympho, nguyên sợi bào…bao bọc bên ngoài 1 lõi kháng nguyên. Quá trình hình thành u hạt thƣờng diễn ra trong một tháng. Khi u hạt hình thành, quá trình viêm đã đi vào GD mạn tính với đặc trƣng là sự tham gia tích cực của các thành phần tế bào. Một thuốc có tác dụng ức chế u hạt tức là có tác dụng chống viêm mạn tính.
Theo Nguyễn Thái An (2003), đơn lá đỏ có tác dụng chống viêm mạn tính gây bởi u hạt thực nghiệm tuy nhiên còn hạn chế [1].
Theo Nguyễn Hoàng Hải (2001), núc nác đƣợc chứng minh có tác dụng chống viêm mạn tính gây bởi u hạt thực nghiệm, liều núc nác 25g/kg/ngày có tỷ lệ ức chế u hạt ở các lô chuột tƣơng đƣơng dùng indomethaxin 4mg/kg/ngày [11].
Các vị thuốc còn lại tuy chƣa có những bài nghiên cứu thử nghiệm theo phƣơng pháp gây u hạt thực nghiệm để chứng minh tác dụng nhƣng dân gian đã sử dụng chúng từ lâu trong các bài thuốc điều trị mụn nhọt, lở loét, ban chẩn [18], [30], [31].
Kết quả bài thuốc cho thấy ở liều tƣơng đƣơng dùng trên ngƣời, cả cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol đều có tác dụng rõ rệt trong ức chế sự phát triển của u hạt. Điều này phù hợp với những nghiên cứu trƣớc đây đã chỉ ra thành phần bài thuốc cho thấy xu hƣớng tác dụng trên ức chế tạo u hạt. Sự kết hợp giữa các vị thuốc là phù hợp giúp tăng khả năng ức chế tạo hạt ở các chuột.
Tuy nhiên, khi tăng liều, tác dụng ức chế tạo u hạt lại không đƣợc biểu hiện ở cao chiết ethanol. Còn ở cao sắc nƣớc, tác dụng ức chế tạo u hạt có tăng nhƣng không có ý nghĩa thống kê và thể hiện tác dụng bài thuốc không phụ thuộc vào liều.
Kết quả các thực nghiệm về chống viêm cấp và mạn tính cho thấy liều tác dụng tốt hơn trên chống viêm của cao chiết xuất bài thuốc là liều tƣơng đƣơng lâm sàng (cao chiết ethanol 2.11 g cao/kg TT, cao sắc nƣớc 3.54g cao/ kg TT). Khi tăng liều sử dụng, cả hai loại cao đều cho thấy những mặt hạn chế trong việc điều trị, thậm chí giảm tác dụng điều trị rõ rệt. Do đó, trong điều kiện cho phép, nên nghiên cứu thêm các liều thấp hơn liều tƣơng đƣơng lâm sàng và các liều trung gian giữa liều tƣơng đƣơng và liều cao để có cái nhìn toàn vẹn nhất về tác dụng của bài thuốc, từ đó chọn ra liều điều trị phù hợp nhất.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT