3.2.1. Bào chế cao sắc nƣớc
Hình 3.1. Sơ đồ bào chế cao theo phƣơng pháp sắc
- Chuẩn bị dược liệu:
Dƣợc liệu Dƣợc liệu đã làm ẩm Dịch chiết nƣớc Dịch lọc Cao đặc Cô cách thủy Để nguội, lắng, lọc Sắc nóng bằng nƣớc cất Bã dƣợc liệu Rửa sạch, sấy, thấm ẩm
Dƣợc liệu đã đƣợc rửa sạch và sấy ở 60o
C theo tiêu chuẩn của DĐVN IV. Chiết xuất tƣơng đƣơng 15 thang thuốc: Cân khối lƣợng các vị thuốc nhƣ sau: Kim ngân đằng 300g Hòe hoa 150g Thƣơng nhĩ tử 105g Núc nác 225g Đơn lá đỏ 75g Hoàng bá 45g - Chiết xuất:
Các dƣợc liệu đƣợc cân theo đúng khối lƣợng bài thuốc, trộn đều, cho vào ấm đun thuốc Hàn Quốc, thêm lƣợng nƣớc cất gấp 6 lần lƣợng dƣợc liệu. Thấm ẩm trong 30 phút. Bật ấm đun. Sắc nóng trong 1 tiếng. Sắc thuốc 3 lần. Thêm nƣớc để duy trì lƣợng nƣớc không đổi.
Rút dịch chiết, dịch chiết 1 để riêng, dịch chiết 2, 3 gộp chung. Lọc nóng qua vải gạc để loại bỏ tạp chất cơ học. Để nguội, lắng. Lọc dịch lần 2 qua bông để loại tạp không tan.
- Cô cao:
Cô bằng dụng cụ có miệng rộng, cô cách thủy bằng bếp cách thủy, ở nơi thoáng để bay hơi nhanh. Cô dịch chiết 2, 3 trƣớc, dịch chiết 1 sau. Dịch chiết 2, 3 cô đến cao lỏng 1:1 thì phối hợp với dịch chiết 1, tiếp tục cô đến thể chất quy định trong DĐVN IV. Trong quá trình cô chú ý khuấy đảo liên tục để tránh lắng xuống đáy gây cháy khét và tăng khả năng bay hơi.
Kết quả
Kết quả bào chế cao sắc nƣớc đƣợc thể hiện ở bảng sau
Bảng 3.1. Kết quả bào chế cao thuốc theo phƣơng pháp sắc
Khối lƣợng dƣợc liệu (g) Khối lƣợng cao (g) Hiệu suất (%)
900 225,04 25,00
900 220,35 24,48
900 218,41 24,27
Trung bình 221,267 24,58
900g dƣợc liệu (tƣơng đƣơng 15 thang) đầu vào cho ra 221,267g cao có thể tích trung bình 200ml (tức là 1g cao tƣơng đƣơng 4,06g dƣợc liệu hay 1ml cao tƣơng ứng 4,5g dƣợc liệu). Hiệu suất cao: 24,58%.
3.2.2. Bào chế cao chiết ethanol
Hình 3.2. Sơ đồ bào chế cao theo phƣơng phápchiết bằng ethanol
- Chuẩn bị dược liệu, dung môi:
Dƣợc liệu đã đƣợc rửa sạch và sấy ở 60o
C theo tiêu chuẩn của DĐVN IV. Chia nhỏ: Các vị dƣợc liệu đƣợc chia nhỏ đến kích thƣớc phù hợp: xay thô. Chiết xuất tƣơng đƣơng 15 thang thuốc: Cân khối lƣợng các vị thuốc nhƣ sau: Kim ngân đằng 300g Hòe hoa 150g Thƣơng nhĩ tử 105g Núc nác 225g Đơn lá đỏ 75g Hoàng bá 45g
Dung môi chiết ethanol 70%: Ethanol thực phẩm tuyệt đối thêm nƣớc cất vừa đủ để đƣợc ethanol 70%.
Dƣợc liệu
Bột thô dƣợc liệu
Dịch chiết ethanol
Dịch chiết sau thu hồi dung môi
Dịch chiết sau ly tâm Cao lỏng 1:1 Cao đặc Phối hợp các vị, cô cách thủy Ly tâm Cô cách thủy Lắng, lọc, cất thu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hồi dung môi. Ethanol thu hồi
Chiết bằng ethanol 70% Bã dƣợc liệu
Rửa sạch, sấy, xay thô
- Chiết xuất:
Các vị dƣợc liệu đƣợc chiết riêng. Mỗi vị đƣợc cho vào bình cầu có nút mài dung tích 500ml và 1000ml (tùy theo trọng lƣợng vị thuốc), thêm dung môi ethanol 70% gấp 7 lần lƣợng dƣợc liệu. Lắp bình cầu vào sinh hàn. Chiết nóng theo phƣơng pháp hồi lƣu cách thủy trên bếp cách thủy 3 lần, mỗi lần 2 giờ.
Rút dịch chiết sau mỗi 2h, để nguội, lắng, lọc qua bông để loại tạp không tan. Dịch chiết lần 1 đậm đặc để riêng, các dịch chiết lần 2, 3 gộp chung.
Cất thu hồi dung môi ethanol bằng máy cất quay. Ly tâm loại các tạp nhựa lơ lửng trong dịch chiết.
- Cô cao:
Cô riêng từng vị bằng dụng cụ có miệng rộng, cô cách thủy bằng bếp cách thủy, ở nơi thoáng để bay hơi nhanh. Cô dịch chiết 2, 3 trƣớc, dịch chiết 1 sau. Dịch chiết 2, 3 cô trƣớc rồi phối hợp với dịch chiết 1, tiếp tục cô đến cao lỏng 1:1. Gộp các cao của từng vị dƣợc liệu vào tiếp tục cô cách thủy đến khi đạt thể chất theo quy định DĐVN IV. Trong quá trình cô chú ý khuấy đảo liên tục để tránh lắng xuống đáy gây cháy khét và tăng khả năng bay hơi.
Kết quả
Kết quả bào chế cao sắc nƣớc đƣợc thể hiện ở bảng sau
Bảng 3.2. Kết quả bào chế cao thuốc theo phƣơng pháp chiết bằng ethanol
Khối lƣợng dƣợc liệu (g) Khối lƣợng cao (g) Hiệu suất (%)
900 131,06 14,56
900 123,81 13,76
900 141,35 15,70
Trung bình 132,073 14,67
900g dƣợc liệu (tƣơng đƣơng 15 thang) đầu vào cho ra 132,073g cao có thể tích trung bình 90ml (tức là 1g cao tƣơng đƣơng 6,81g dƣợc liệu hay 1ml cao tƣơng ứng 10g dƣợc liệu). Hiệu suất: 14,67%.
Có thể thấy phƣơng pháp bào chế chế cao bằng phƣơng pháp sắc nƣớc cho khối lƣợng cao nhiều hơn phƣơng pháp bào chế bằng chiết ethanol.
Phƣơng pháp sắc nƣớc là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, thu đƣợc khối lƣợng cao lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp sắc với dung môi nƣớc - dung môi có khả năng hòa tan rộng nên dịch chiết có nhiều tạp chất tan đƣợc trong nƣớc. Điều này dẫn tới nồng độ chất chiết trong dƣợc liệu thƣờng nhỏ.
Trong khi đó, phƣơng pháp chiết ethanol lại có ƣu điểm là loại đƣợc 1 số tạp tan trong nƣớc không tan trong ethanol. Lƣợng cao thu đƣợc ít hơn nhƣng cao thu đƣợc lại có thể chất đặc hơn - nồng độ chất chiết đậm đặc hơn. Tuy nhiên, phƣơng pháp chiết bằng ethanol cần phải qua nhiều công đoạn loại tạp trong đó có chất nhựa (tạp chiếm lƣợng lớn trong các dƣợc liệu đơn lá đỏ, hoàng bá, núc nác, hòe hoa), có thể làm mất nhiều hoạt chất có trong dịch chiết sau mỗi công đoạn lọc, ly tâm hơn phƣơng pháp sắc nƣớc.
Khi chiết xuất và cô cao thành cao đặc, khối lƣợng cao thu đƣợc ít hơn so với cao lỏng hay dịch chiết, thể chất sánh đặc hơn nên dễ bảo quản, vận chuyển và sử dụng hơn thuốc thang, thuận tiện để sản xuất các sản phẩm tiếp theo nhƣ chế thành cao khô hay bào chế dạng viên (nén, nang…) góp phần làm phát triển khu vực ứng dụng và sử dụng của cao thuốc y học cổ truyển.
Một số chỉ tiêu cảm quan, hàm ẩm, pH của cao đặc bài thuốc EZ: - Độ đồng nhất: Cao chiết ethanol và cao sắc nƣớc đều đồng nhất. - Màu sắc: Cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol có màu nâu đen.
- Mùi: Cao chiết ethanol và cao sắc nƣớc có mùi thơm ngọt đắng. - Vị: Cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol đều có vị đắng hơi chát. - Hàm ẩm, pH: Cao chiết ethanol: Hàm ẩm: 18,80%, pH: 4,28.
Cao sắc nƣớc: 19,33%, pH: 4,57.
3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BÀI THUỐC 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm thử 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm thử
Nguyên tắc tính liều: Theo liều phƣơng thuốc cổ truyền là 1 thang thuốc/ngƣời (50kg)/ngày.
Suy ra liều cao đặc bài thuốc cho 1 ngƣời (50kg)/ngày nhƣ sau: - Cao sắc nước: 14,75g cao/ngƣời (50kg)/ngày.
- Cao chiết ethanol: 8,80g cao/ngƣời (50kg)/ngày.
Ngoại suy: Hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tƣơng đƣơng giữa ngƣời và động vật thí nghiệm - chuột nhắt trắng là 12. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Suy ra liều tƣơng đƣơng ngoại suy trên chuột nhắt trắng là: - Liều tương đương tác dụng của cao sắc nước: 3,54g cao/kg TT/ngày. - Liều tương đương tác dụng của cao chiết ethanol: 2,11g cao/kg TT/ngày.
Từ đó làm cơ sở tính toán liều thử tác dụng sinh học: Thử ở các mức liều sau: - Cao sắc nước:
Liều thấp: bằng liều tƣơng đƣơng: 3,54g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tƣơng đƣơng: 10,62g cao/kg TT/ngày.
- Cao chiết ethanol:
Liều thấp: bằng liều tƣơng đƣơng: 2,11g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tƣơng đƣơng: 6,33g cao/kg TT/ngày.
- Thuốc đối chiếu:
Liều asprin chống viêm sử dụng trên chuột trong thực nghiệm là: 200mg/kg TT/ngày.
Liều methylprednisolon chống viêm trên chuột trong thực nghiệm là: 20mg/kg TT một liều duy nhất.
Liều prenisolon chống viêm trên chuột trong thực nghiệm là: 10mg/kg TT/ngày [9], [32].
3.3.2. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn
- Giống vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gram(+) Vi khuẩn Gram(-)
Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922 Bacillus pumilus ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201 Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonela typhi DT 220
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri
- VSV đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng phù hợp, pha theo tỷ lệ ở bảng sau: MT canh thanh: NaCl 0,5%, cao thịt 0,3%, pepton 0,5%, pH 7,0-7,4.
MT thạch thƣờng: NaCl 0,5%, cao thịt 0,3%, pepton 0,5%, thạch 1,8%, pH 7,0-7,4.
- Kháng sinh tham chiếu: Gentamycin 100µg/ml, Penicillin G 100µg/ml [3]. - Tiến hành:
Pha loãng cao dƣợc liệu theo các nồng độ cách nhau 2 lần: Cân chính xác 200mg cao hòa tan trong 2ml nƣớc. Ly tâm lấy dịch trong làm dung dịch gốc C1 (100mg/ml). Hòa loãng tiếp với nƣớc để đƣợc các nồng độ thử thấp hơn là C2 (50mg/ml), C3 (25mg/ml).
Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định, cấy vào 2,5ml môi trƣờng canh thang, ủ ở 37o
C trong 16-24h để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml.
Cấy hỗn dịch VSV vào môi trƣờng thạch thƣờng đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50oC với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.
Đƣa mẫu thử và hai kháng sinh tham chiếu (Penicillin, Gentamycin) vào môi tƣờng kiểm định theo phƣơng pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã đƣợc tẩm 3 lần dịch chiết của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dƣới 50o
C, sau đó đặt lên bề mặt môi trƣờng đã cấy VSV kiểm định tại 7 điểm trên đĩa petri.
Các đĩa Petri có mẫu thử đƣợc ủ trong tủ ấm ở 37o
C trong 18-24h. Mỗi mẫu đƣợc thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
Đánh giá kết quả: Đo đƣờng kính vòng vô khuẩn bằng thƣớc kẹp Palmer (độ chính xác 0.02mm) [3].
Kết quả
Kết quả thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn của cao thuốc chiết bằng hai phƣơng pháp sắc nƣớc và chiết ethanol đƣợc thể hiện theo hai bảng dƣới đây:
Bảng 3.3. Kết quả thử kháng khuẩn cao sắc nƣớc ở các nồng độ pha loãng khác nhau Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Vi khuẩn SA BP BS BC SL SF EC PM ST PA Gr (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) Cao sắc nƣớc [C1] 10,76±0,59 13,40±1,01 - 10,05±0,35 - - 11,35±1,09 12,31±0,41 - - [C2] 9,12±0,41 12,15±0,73 - 7,78±0,49 - - 10,87±0,52 11,16±0,73 - - [C3] 7,37 ± 1,21 10,46±0,89 - 6,85±1,37 - - 7,67±0,31 10,20±1,21 - - Chuẩn Gen - - - - - 11,24±0,57 12,36±0,89 12,70±0,62 13,40±0,31 - Pen 11,46±0,12 - 12,24±0,53 11,78±0,49 12,91±0,02 - - - - - Chú thích: -: âm tính (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.4. Kết quả thử kháng khuẩn cao chiết ethanol ở các nồng độ pha loãng khác nhau Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Vi khuẩn SA BP BS BC SL SF EC PM ST PA Gr (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) Cao chiết ethanol [C1] 12,27±0,49 18,36±0,62 - 11,72±0,36 - - 12,15±1,21 18,72±0,56 - - [C2] 10,62±0,27 13,54±0,76 - 10,65±0,91 - - 11,32±0,41 16,28±0,43 - - [C3] 8,29±0,45 9,56±0,32 - 8,23±1,01 - - 8,74±0,37 14,20±1,01 - - Chuẩn Gen - - - - - 11,24±0,57 12,36±0,89 12,70±0,62 13,40±0,31 - Pen 11,46±0,12 - 12,24±0,53 11,78±0,49 12,91±0,02 - - - - - Chú thích: -: âm tính Nhận xét + Cao sắc nước:
Cao sắc nƣớc có tác dụng trên chủng vi khuẩn Gr (+) là Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus cereus và các chủng vi khuẩn Gr (-) là
Escherichia coli, Proteus mirabilis.
Ở nồng độ 100mg/ml, cao sắc nƣớc cho tác dụng kháng khuẩn cao nhất. Tác dụng kháng khuẩn giảm nhẹ dần khi giảm nồng độ cao.
Đặc biệt, với vi khuẩn Gr (+), cao sắc nƣớc ức chế đƣợc Bacillus pumilus
trong khi Penicillin âm tính với vi khuẩn này.
Với vi khuẩn Gr (-), cao sắc nƣớc ức chế đƣợc E.coli và P. mirabilis. Đặc biệt trên P. mirabilis, cao sắc nƣớc ức chế mạnh chủng vi khuẩn này.
+ Cao chiết ethanol:
Cao chiết ethanol cũng có tác dụng trên chủng vi khuẩn Gr (+) là S. aureus, B. pumilus, B. cereus và các chủng vi khuẩn Gr (-) là E. coli, P. mirabilis.
Khả năng ức chế giảm mạnh theo sự giảm nồng độ cao.
Tác dụng ức chế của cao chiết ethanol ở mọi chủng vi khuẩn đều mạnh hơn cao sắc nƣớc.
Nhƣ vậy, 200mg cao thuốc bài thuốc EZ có tác dụng ức chế 3 chủng Gr (+) và 2 chủng Gr (-). Đặc biệt trên chủng P. mirabilis và B. pumilus, cao thuốc cho kết quả ức chế rất tốt.
3.3.3. Khảo sát độc tính cấp
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18-22g. Chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con.
- Tiến hành:
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm.
Từng lô chuột nhắt trắng, mỗi lô ít nhất 10 con, đƣợc uống cao lỏng toàn phần theo liều tăng dần. Tìm liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100%) và các liều trung gian. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu [36], [55].
Kết quả
+ Độc tính cấp của cao sắc nước
Sau khi uống thuốc thử cao sắc nƣớc, chuột trong các lô uống liều thấp 30g cao (tƣơng đƣơng 121,80g dƣợc liệu)/kg TT không có hiện tƣợng gì đặc biệt: ăn uống, vận động bình thƣờng, chuột không bị khó thở, đi ngoài phân khô, không thấy xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc thử. Các lô chuột uống liều từ 35g cao (tƣơng đƣơng 142,10g dƣợc liệu)/kg TT chuột, các chuột giảm vận động, ăn uống ít, một số chuột bị tiêu chảy và xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuột chết ở các lô đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Tƣơng quan liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao sắc nƣớc
Lô chuột Thể tích cao đã
uống (ml) Liều (g dƣợc liệu/kg) Tỷ lệ chuột chết (%) 1 25 112,50 0 2 30 135,00 0 3 35 157,50 10 4 40 180,00 20 5 55 247,50 30 6 60 270,00 40 7 65 292,50 50 8 70 315,00 90 9 75 337,50 100
Từ bảng trên vẽ đƣợc đồ thị biểu diễn mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết:
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao sắc nƣớc
y = 0.4132x - 56.214 R² = 0.8749 -50 0 50 100 150 0 100 200 300 400 Tỷ lệ huột chết (%) Liều (g/kg)
Từ đó tính đƣợc LD50 = 257,05 (272,96-225,23)g dƣợc liệu/kg TT.
+ Độc tính của cao chiết ethanol
Sau khi uống thuốc thử cao chiết ethanol, chuột trong các lô uống liều thấp dƣới 33g cao (tƣơng đƣơng 227g dƣợc liệu)/kg TT không có hiện tƣợng gì đặc biệt: chuột ăn uống, vận động bình thƣờng, chuột không bị khó thở, đi ngoài phân khô, không thấy xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc thử. Các lô chuột uống liều từ 40g cao (tƣơng đƣơng 272,40g dƣợc liệu)/kg TT chuột, các chuột giảm vận động, ăn uống ít, một số chuột bị tiêu chảy và xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuột chết ở các lô đƣợc trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Tƣơng quan liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao chiết ethanol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô chuột Thể tích cao
(ml) Liều (g dƣợc liệu/kg) Tỷ lệ chuột chết (%) 1 20 200 0 2 25 250 0 3 30 300 10 4 35 350 20 5 40 400 40 6 42,5 425 50 7 45 450 60 8 50 500 80 9 55 550 90 10 60 600 100
Từ đó vẽ đƣợc đồ thị biểu diễn mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết:
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao chiết ethanol
y = 0.2831x - 68.95 R² = 0.9693 -50 0 50 100 150 0 100 200 300 400 500 600 700 Tỷ lệ chuột chết (%) Liều (g/kg)
Từ đó tính đƣợc LD50 = 420,32 (455,68 - 349,60)g dƣợc liệu/kg TT.
3.3.4. Khảo sát tác dụng chống viêm cấp theo phƣơng pháp gây viêm tai