3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm thử
Nguyên tắc tính liều: Theo liều phƣơng thuốc cổ truyền là 1 thang thuốc/ngƣời (50kg)/ngày.
Suy ra liều cao đặc bài thuốc cho 1 ngƣời (50kg)/ngày nhƣ sau: - Cao sắc nước: 14,75g cao/ngƣời (50kg)/ngày.
- Cao chiết ethanol: 8,80g cao/ngƣời (50kg)/ngày.
Ngoại suy: Hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tƣơng đƣơng giữa ngƣời và động vật thí nghiệm - chuột nhắt trắng là 12.
Suy ra liều tƣơng đƣơng ngoại suy trên chuột nhắt trắng là: - Liều tương đương tác dụng của cao sắc nước: 3,54g cao/kg TT/ngày. - Liều tương đương tác dụng của cao chiết ethanol: 2,11g cao/kg TT/ngày.
Từ đó làm cơ sở tính toán liều thử tác dụng sinh học: Thử ở các mức liều sau: - Cao sắc nước:
Liều thấp: bằng liều tƣơng đƣơng: 3,54g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tƣơng đƣơng: 10,62g cao/kg TT/ngày.
- Cao chiết ethanol:
Liều thấp: bằng liều tƣơng đƣơng: 2,11g cao/kg TT/ngày. Liều cao: gấp ba liều tƣơng đƣơng: 6,33g cao/kg TT/ngày.
- Thuốc đối chiếu:
Liều asprin chống viêm sử dụng trên chuột trong thực nghiệm là: 200mg/kg TT/ngày.
Liều methylprednisolon chống viêm trên chuột trong thực nghiệm là: 20mg/kg TT một liều duy nhất.
Liều prenisolon chống viêm trên chuột trong thực nghiệm là: 10mg/kg TT/ngày [9], [32].
3.3.2. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn
- Giống vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gram(+) Vi khuẩn Gram(-)
Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922 Bacillus pumilus ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201 Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonela typhi DT 220
Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri
- VSV đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng phù hợp, pha theo tỷ lệ ở bảng sau: MT canh thanh: NaCl 0,5%, cao thịt 0,3%, pepton 0,5%, pH 7,0-7,4.
MT thạch thƣờng: NaCl 0,5%, cao thịt 0,3%, pepton 0,5%, thạch 1,8%, pH 7,0-7,4.
- Kháng sinh tham chiếu: Gentamycin 100µg/ml, Penicillin G 100µg/ml [3]. - Tiến hành:
Pha loãng cao dƣợc liệu theo các nồng độ cách nhau 2 lần: Cân chính xác 200mg cao hòa tan trong 2ml nƣớc. Ly tâm lấy dịch trong làm dung dịch gốc C1 (100mg/ml). Hòa loãng tiếp với nƣớc để đƣợc các nồng độ thử thấp hơn là C2 (50mg/ml), C3 (25mg/ml).
Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định, cấy vào 2,5ml môi trƣờng canh thang, ủ ở 37o
C trong 16-24h để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106-108 tế bào/ml.
Cấy hỗn dịch VSV vào môi trƣờng thạch thƣờng đã tiệt trùng và để nguội đến 45-50oC với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa.
Đƣa mẫu thử và hai kháng sinh tham chiếu (Penicillin, Gentamycin) vào môi tƣờng kiểm định theo phƣơng pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã đƣợc tẩm 3 lần dịch chiết của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dƣới 50o
C, sau đó đặt lên bề mặt môi trƣờng đã cấy VSV kiểm định tại 7 điểm trên đĩa petri.
Các đĩa Petri có mẫu thử đƣợc ủ trong tủ ấm ở 37o
C trong 18-24h. Mỗi mẫu đƣợc thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
Đánh giá kết quả: Đo đƣờng kính vòng vô khuẩn bằng thƣớc kẹp Palmer (độ chính xác 0.02mm) [3].
Kết quả
Kết quả thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn của cao thuốc chiết bằng hai phƣơng pháp sắc nƣớc và chiết ethanol đƣợc thể hiện theo hai bảng dƣới đây:
Bảng 3.3. Kết quả thử kháng khuẩn cao sắc nƣớc ở các nồng độ pha loãng khác nhau Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Vi khuẩn SA BP BS BC SL SF EC PM ST PA Gr (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) Cao sắc nƣớc [C1] 10,76±0,59 13,40±1,01 - 10,05±0,35 - - 11,35±1,09 12,31±0,41 - - [C2] 9,12±0,41 12,15±0,73 - 7,78±0,49 - - 10,87±0,52 11,16±0,73 - - [C3] 7,37 ± 1,21 10,46±0,89 - 6,85±1,37 - - 7,67±0,31 10,20±1,21 - - Chuẩn Gen - - - - - 11,24±0,57 12,36±0,89 12,70±0,62 13,40±0,31 - Pen 11,46±0,12 - 12,24±0,53 11,78±0,49 12,91±0,02 - - - - - Chú thích: -: âm tính
Bảng 3.4. Kết quả thử kháng khuẩn cao chiết ethanol ở các nồng độ pha loãng khác nhau Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Vi khuẩn SA BP BS BC SL SF EC PM ST PA Gr (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-) Cao chiết ethanol [C1] 12,27±0,49 18,36±0,62 - 11,72±0,36 - - 12,15±1,21 18,72±0,56 - - [C2] 10,62±0,27 13,54±0,76 - 10,65±0,91 - - 11,32±0,41 16,28±0,43 - - [C3] 8,29±0,45 9,56±0,32 - 8,23±1,01 - - 8,74±0,37 14,20±1,01 - - Chuẩn Gen - - - - - 11,24±0,57 12,36±0,89 12,70±0,62 13,40±0,31 - Pen 11,46±0,12 - 12,24±0,53 11,78±0,49 12,91±0,02 - - - - - Chú thích: -: âm tính Nhận xét + Cao sắc nước:
Cao sắc nƣớc có tác dụng trên chủng vi khuẩn Gr (+) là Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus cereus và các chủng vi khuẩn Gr (-) là
Escherichia coli, Proteus mirabilis.
Ở nồng độ 100mg/ml, cao sắc nƣớc cho tác dụng kháng khuẩn cao nhất. Tác dụng kháng khuẩn giảm nhẹ dần khi giảm nồng độ cao.
Đặc biệt, với vi khuẩn Gr (+), cao sắc nƣớc ức chế đƣợc Bacillus pumilus
trong khi Penicillin âm tính với vi khuẩn này.
Với vi khuẩn Gr (-), cao sắc nƣớc ức chế đƣợc E.coli và P. mirabilis. Đặc biệt trên P. mirabilis, cao sắc nƣớc ức chế mạnh chủng vi khuẩn này.
+ Cao chiết ethanol:
Cao chiết ethanol cũng có tác dụng trên chủng vi khuẩn Gr (+) là S. aureus, B. pumilus, B. cereus và các chủng vi khuẩn Gr (-) là E. coli, P. mirabilis.
Khả năng ức chế giảm mạnh theo sự giảm nồng độ cao.
Tác dụng ức chế của cao chiết ethanol ở mọi chủng vi khuẩn đều mạnh hơn cao sắc nƣớc.
Nhƣ vậy, 200mg cao thuốc bài thuốc EZ có tác dụng ức chế 3 chủng Gr (+) và 2 chủng Gr (-). Đặc biệt trên chủng P. mirabilis và B. pumilus, cao thuốc cho kết quả ức chế rất tốt.
3.3.3. Khảo sát độc tính cấp
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18-22g. Chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con.
- Tiến hành:
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm.
Từng lô chuột nhắt trắng, mỗi lô ít nhất 10 con, đƣợc uống cao lỏng toàn phần theo liều tăng dần. Tìm liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100%) và các liều trung gian. Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu [36], [55].
Kết quả
+ Độc tính cấp của cao sắc nước
Sau khi uống thuốc thử cao sắc nƣớc, chuột trong các lô uống liều thấp 30g cao (tƣơng đƣơng 121,80g dƣợc liệu)/kg TT không có hiện tƣợng gì đặc biệt: ăn uống, vận động bình thƣờng, chuột không bị khó thở, đi ngoài phân khô, không thấy xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc thử. Các lô chuột uống liều từ 35g cao (tƣơng đƣơng 142,10g dƣợc liệu)/kg TT chuột, các chuột giảm vận động, ăn uống ít, một số chuột bị tiêu chảy và xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuột chết ở các lô đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Tƣơng quan liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao sắc nƣớc
Lô chuột Thể tích cao đã
uống (ml) Liều (g dƣợc liệu/kg) Tỷ lệ chuột chết (%) 1 25 112,50 0 2 30 135,00 0 3 35 157,50 10 4 40 180,00 20 5 55 247,50 30 6 60 270,00 40 7 65 292,50 50 8 70 315,00 90 9 75 337,50 100
Từ bảng trên vẽ đƣợc đồ thị biểu diễn mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết:
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao sắc nƣớc
y = 0.4132x - 56.214 R² = 0.8749 -50 0 50 100 150 0 100 200 300 400 Tỷ lệ huột chết (%) Liều (g/kg)
Từ đó tính đƣợc LD50 = 257,05 (272,96-225,23)g dƣợc liệu/kg TT.
+ Độc tính của cao chiết ethanol
Sau khi uống thuốc thử cao chiết ethanol, chuột trong các lô uống liều thấp dƣới 33g cao (tƣơng đƣơng 227g dƣợc liệu)/kg TT không có hiện tƣợng gì đặc biệt: chuột ăn uống, vận động bình thƣờng, chuột không bị khó thở, đi ngoài phân khô, không thấy xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc thử. Các lô chuột uống liều từ 40g cao (tƣơng đƣơng 272,40g dƣợc liệu)/kg TT chuột, các chuột giảm vận động, ăn uống ít, một số chuột bị tiêu chảy và xuất hiện chuột chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuột chết ở các lô đƣợc trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Tƣơng quan liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao chiết ethanol
Lô chuột Thể tích cao
(ml) Liều (g dƣợc liệu/kg) Tỷ lệ chuột chết (%) 1 20 200 0 2 25 250 0 3 30 300 10 4 35 350 20 5 40 400 40 6 42,5 425 50 7 45 450 60 8 50 500 80 9 55 550 90 10 60 600 100
Từ đó vẽ đƣợc đồ thị biểu diễn mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết:
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa liều lƣợng và tỷ lệ chuột chết sau khi uống cao chiết ethanol
y = 0.2831x - 68.95 R² = 0.9693 -50 0 50 100 150 0 100 200 300 400 500 600 700 Tỷ lệ chuột chết (%) Liều (g/kg)
Từ đó tính đƣợc LD50 = 420,32 (455,68 - 349,60)g dƣợc liệu/kg TT.
3.3.4. Khảo sát tác dụng chống viêm cấp theo phƣơng pháp gây viêm tai
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18-22g.
- Tiến hành: 70 chuột nhắt trắng đƣợc chia ngẫu nhiên thành 6 lô, mỗi lô 10 con.
Lô 1 (chứng): gây mô hình viêm ở tai phải và uống nƣớc cất 0,2mg/10g TT chuột.
Lô 2 (methylprednisolon): gây mô hình viêm ở tai phải và uống Methylpred- nisolon với liều 20 mg/kg một lần duy nhất.
Lô 3 (cao ethanol liều thấp): gây mô hình viêm ở tai phải và uống cao chiết ethanol (liều tƣơng đƣơng lâm sàng) 2,11g cao/kg TT/ngày với thể tích 0,2 ml/10g TT trong 3 ngày liên tiếp.
Lô 4 (cao ethanol liều cao): gây mô hình viêm ở tai phải và uống cao chiết ethanol (liều gấp 3 lần liều tƣơng đƣơng lâm sàng) 6,33g cao/kg TT/ngày với thể tích 0,2 ml/10g TT trong 3 ngày liên tiếp.
Lô 5 (cao nƣớc liều thấp): gây mô hình viêm ở tai phải và uống cao sắc nƣớc (liều tƣơng đƣơng) 3,54g cao/kg TT/ngày với thể tích 0,2 ml/10g TT trong 3 ngày liên tiếp.
Lô 6 (cao nƣớc liều cao): gây mô hình viêm ở tai phải và uống cao sắc nƣớc liều cao (liều gấp 3 lần liều tƣơng đƣơng lâm sàng) 10,62g cao/kg TT/ngày với thể tích 0,2 ml/10g TT trong 3 ngày liên tiếp.
- Tác nhân gây viêm tai chuột là dầu croton pha trong aceton.
Cách pha: Pha 40mg dầu croton vào 2ml aceton (nhƣ vậy trong mỗi 20µl hỗn hợp sẽ chứa 0,4mg dầu croton).
- Tiến hành:
Chuột đƣợc uống thuốc thử 2 ngày trƣớc khi làm nghiên cứu và ngày thứ 3 trƣớc khi gây mô hình 1h với liều lƣợng nhƣ trên. Một giờ sau khi uống thuốc thử lần thứ 3, toàn bộ chuột đƣợc gây mô hình bằng dầu croton trên tai phải.
Trƣớc khi gây mô hình bằng dung dịch dầu croton (trong aceton), chuột đƣợc đo chiều dày tai ở tất cả các lô. Đo chiều dày tai tại vị trí sát đỉnh của tai cách xa chóp sụn vành tai.
Gây mô hình viêm: Bôi lên mặt ngoài tai phải chuột 20µl dung dịch dầu croton để gây mô hình viêm tai trên chuột ở tất cả các lô. Ở tất cả các chuột bôi croton, tai trái không gây mô hình và không bôi thuốc gì.
6h sau khi gây mô hình, chuột đƣợc gây mê bằng thiopental. Tai chuột đƣợc đo lại chiều dày, sau đó dùng sinh thiết cắt ở phần trung tâm với đƣờng kính 7mm để đo cân nặng [33].
Kết quả_Nhận xét
+ Về cân nặng: Cân nặng đƣợc thể hiện ở bảng sau
Bảng 3.7. Cân nặng trung bình của các lô chuột
Lô Thuốc thử Cân nặng ( SD, g)
1 Chứng 24,41,3
2 Methylprednisolon 25,12,0
3 Cao ethanol liều thấp 25,21,8
4 Cao ethanol liều cao 25,01,3
5 Cao nƣớc liều thấp 24,41,2
6 Cao nƣớc liều cao 24,41,2
Bảng 3.7. cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (test ANOVA) về cân nặng giữa các lô với nhau. Khi so sánh từng lô với lô chứng (t-test student) cũng không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Điều này đảm bảo sự tƣơng đồng về mặt sinh học giữa các lô chuột thí nghiệm.
+ Về chiều dày tai chuột:
Bảng 3.8. dƣới đây thể hiện sự thay đổi vể chiều dày tai trƣớc và sau khi gây mô hình 6h.
Bảng 3.8. Chiều dày tai bên phải của chuột trƣớc và sau khi gây mô hình 6h
Lô Thuốc thử n
Chiều dày tai chuột
( SD,µm)
Trƣớc Sau 6h
1 Chứng 10 21,20 3,29 27,00 3,68+
2 Methylprednisolon 10 21,00 4,32 23,40 3,12* 3 Cao ethanol liều thấp 10 21,80 3,71 25,40 3,86+ 4 Cao ethanol liều cao 10 19,80 2,39 26,00 4,71+ 5 Cao nƣớc liều thấp 10 20,60 4,01 25,40 3,53+ 6 Cao nƣớc liều cao 10 19,80 3,05 25,20 3,29+
Chú thích: +: Khác biệt so với trước, test t ghép cặp, p < 0,05
*: Khác biệt so với lô chứng tại cùng thời điểm, test t-Student, p < 0,05
Từ kết quả bảng 3.8. thấy:
Không có sự khác biệt về chiều dày tai bên phải ở thời điểm trƣớc nghiên cứu giữa các lô (test ANOVA). Kết quả này phù hợp với kết quả ở bảng 3.8: Tƣơng đồng sinh học giữa các lô chuột đƣợc đảm bảo.
Đối với lô 1 chứng chỉ đƣợc bôi dầu croton, chiều dày của tai phải tăng lên rõ rệt, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với ban đầu (test t ghép cặp), điều đó cho thấy tác dụng gây viêm cấp của dầu croton trên tai chuột nhắt.
Lô 2 uống methylprednisolon chiều dày tai có tăng nhƣng không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với trƣớc nghiên cứu (test t ghép cặp). Chiều dày tai của lô uống methylprednisolon có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng tại cùng thời điểm (test t Student). Điều này cho thấy methylprednisolon đƣờng uống có tác dụng chống viêm cấp rõ rệt gây ra bởi dầu croton trên tai chuột.
Các lô uống thuốc thử: cao ethanol liều thấp, cao ethanol liều cao, cao nƣớc liều thấp và cao nƣớc liều cao: Đều cho thấy xu hƣớng giảm so với lô chứng, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (test t Student). Ở các lô này, chiều dày tai bên phải tại thời điểm 6h sau khi gây mô hình vẫn tăng có ý nghĩa thống kê so với trƣớc khi gây mô hình.
+ Về khối lượng tai chuột, mức độ ức chế viêm: thể hiện ở bảng sau
Bảng 3.9. Khối lƣợng tai chuột trƣớc và sau khi gây mô hình 6h
Lô Thuốc thử n
Khối lƣợng tai chuột
( SD,µg)
Tai phải Tai trái
1 Chứng 10 33,80 6,37+ 14,20 2,66
2 Methylprednisolon 10 17,60 3,31+* 12,90 1,45 3 Cao ethanol liều thấp 10 30,10 4,36+ 13,90 1,45 4 Cao ethanol liều cao 10 30,01 2,96+ 14,70 3,20 5 Cao nƣớc liều thấp 10 29,30 3,06+ 14,30 2,54 6 Cao nƣớc liều cao 10 30,90 3,35+ 14,00 1,49
Chú thích: +: Khác biệt so với tai bên trái, test t-Student, p < 0,001 *: Khác biệt so với lô chứng, test t-Student, p < 0,001
Tính mức độ ức chế viêm (%) và vẽ biểu đồ thể hiện mức độ ức chế viêm:
Hình 3.5. Biểu đồ thể hiện mức độ ức chế viêm cấp tại chỗ (%)
Có thể thấy:
Ở lô chứng, khối lƣợng tai phải tăng rõ rệt so với tai bên trái, điều đó chứng tỏ tác dụng gây viêm cấp (phù nề) của dầu croton.
Ở lô uống methylprednisolon, khối lƣợng tai giảm rõ rệt so với lô chứng, mức độ ức chế viêm của methylprednisolon là 44,08 %, điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đó cho thấy corticoid có tác dụng mạnh trên mô hình gây viêm cấp bằng dầu croton [33], [34], [39]. X 0 10 20 30 40 50
methylprednisolon cao etoh thấp cao etoh cao
cao nƣớc thấp cao nƣớc cao 44.08 12.43 10.06 12.72 8.88 Mứ c độ ức chế viêm (%) methylprednisolon cao etoh thấp cao etoh cao cao nƣớc thấp cao nƣớc cao
Đối với lô uống cao ethanol liều cao và liều thấp đều cho thấy xu hƣớng giảm