2.1.1. Nguyên liệu
Các vị thuốc kim ngân đằng, núc nác, hòe hoa, thƣơng nhĩ tử, đơn lá đỏ, hoàng bá đã đƣợc chế biến do nhà thuốc Phùng gia đƣờng cung cấp.
2.1.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Trang thiết bị
- Các dụng cụ đo lƣờng đạt tiêu chuẩn kiểm định: ống đong, cốc có mỏ… - Cân kỹ thuật.
- Cân phân tích.
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon.
- Máy đo hàm ẩm Prescisa XM 120. - Máy xay dƣợc liệu.
- Nồi sắc thuốc Hàn Quốc.
- Thiết bị sinh thiết (biosy punch), đƣờng kính 7mm. - Thƣớc đo độ dày: thƣớc Palmer, độ chính xác 0.02mm. - Thuyền tán.
- Tủ sấy Memmert.
- Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 (hãng Ugo – Basile-Italy). - Kim đầu tù.
2.1.2.2. Thuốc thử
- Amiant. - Carrageenin.
- Dầu croton (hãng sản xuất: Sigma – Đức) - Thuốc NSAIDS: Aspirin 100mg.
- Thuốc corticoids: Prednisolon dạng uống.
- Các hóa chất khác: Natriclorid, formaldehyd, aceton…
2.1.2.3. Động vật thí nghiệm
- Chủng vi khuẩn kiểm định: Gram (+), Gram (-) do bộ môn Vi sinh-Sinh học, trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội cung cấp.
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khỏe mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cả hai giống đực và cái, trọng lƣợng từ 18-22g, do Viện vệ sinh dịch tễ trung ƣơng cung cấp, đƣợc nuôi trƣớc một tuần trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nƣớc uống theo tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm bộ môn Dƣợc lý - trƣờng đại học Y Hà Nội.
2.2. PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.2.1. Xác định tính đúng của các vị thuốc 2.2.1. Xác định tính đúng của các vị thuốc
Căn cứ vào các tiêu chuẩn của DĐVN IV, tiến hành khảo sát, đối chiếu đặc điểm hình thái các vị thuốc và đặc viểm soi bột dƣợc liệu [8].
2.2.2. Nghiên cứu phƣơng pháp điều chế cao đặc bài thuốc
Điều chế cao đặc bài thuốc theo 2 phƣơng pháp: sắc, chiết bằng ethanol.
2.2.2.1. Sắc
Các dƣợc liệu đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 60o
C đạt tiêu chuẩn DĐVN IV [8]. Chiết xuất bằng phƣơng pháp sắc với nƣớc. Dịch chiết thu đƣợc cô đặc đến thể chất quy định [4].
2.2.2.2. Chiết bằng ethanol
Các dƣợc liệu đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 60o
C đạt tiêu chuẩn DĐVN IV [8], chia nhỏ đến kích thƣớc thích hợp. Chiết xuất bằng phƣơng pháp chiết nóng hồi lƣu cách thủy với ethanol. Dịch chiết đem cô đặc đến thể chất quy định [19].
2.2.3. Khảo sát tác dụng dƣợc lý của cao đặc bào chế từ bài thuốc EZ
2.2.3.1. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn
- Vi khuẩn thí nghiệm: Vi khuẩn Gr (+), vi khuẩn Gr (-).
- Phƣơng pháp: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán dùng khoanh giấy lọc.
- Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) đƣợc đặt lên lớp thạch dinh dƣỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trƣờng
thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của thuốc càng mạnh.
- Chỉ tiêu quan sát: Đƣờng kính vòng vô khuẩn.
- Chỉ tiêu đánh giá: So sánh đƣờng kính vòng vô khuẩn của mẫu thử với nhau và so sánh với chất tham chiếu.
Đƣờng kính vòng vô khuẩn đƣợc đánh giá theo công thức:
̅ ∑ √∑ ̅
Trong đó:
̅: Đƣờng kính trung bình vòng vô khuẩn.
Di: Đƣờng kính vòng vô khuẩn thứ i (đƣợc xác định bằng thƣớc kẹp Palmer, độ chính xác 0,02mm)
S: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
n: Số thí nghiệm làm song song (thông thƣờng n=3) [3], [28], [32].
2.2.3.2. Độc tính cấp
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18-22g.
- Phƣơng pháp nghiên cứu: Xác định độc tính cấp trên chuột nhắt trắng bằng đƣờng uống theo phƣơng pháp Litchfield – Wilcoxon và hƣớng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [36], [41].
Từng lô chuột nhắt trắng, đƣợc uống mẫu thuốc nghiên cứu theo liều tăng dần đến liều cao nhất có thể cho chuột uống.
- Chỉ tiêu quan sát: Chuột chết hoặc các biểu hiện bất thƣờng khác.
- Chỉ tiêu đánh giá: Tìm liều cao nhất không gây chết chuột (0%), liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn (100%) và các liều trung gian. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử [15], [27], [32], [50], [55].
2.2.3.3. Khảo sát tác dụng chống viêm cấp theo phương pháp gây viêm tai chuột
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18-22g.
- Phƣơng pháp: Nghiên cứu theo phƣơng pháp thực nghiệm trên mô hình gây viêm ở tai chuột nhắt trắng bằng dầu croton đƣợc tiến hành dựa theo mô hình do Tubaro và cộng sự đƣa ra (1985) [33].
Tác nhân gây phù tai chuột là dầu croton. Bôi croton lên vị trí cố định ở mặt ngoài của tai phải chuột, tai trái không bôi để đối chiếu. Sau 2 giờ, giết chuột, dùng dụng cụ đục lỗ hai bên tai chuột ở cùng vị trí. Cân, tính giá trị chênh lệch giữa hai tai. Tính kết quả trung bình và so sánh.
- Chỉ tiêu quan sát: Chênh lệch độ dày, khối lƣợng giữa hai bên tai chuột. - Chỉ tiêu đánh giá: Tính mức độ ức chế viêm tai chuột theo công thức và so sánh giữa các lô thử và lô chứng:
Trong đó: X%: Mức độ ức chế viêm tai chuột. m: Khối lƣợng tai [32], [39], [46].
2.2.3.4. Khảo sát tác dụng chống viêm cấp theo phương pháp gây phù chân chuột
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18-22g.
- Phƣơng pháp nghiên cứu: Phƣơng pháp phù chân chuột gây bằng carrageenin theo Winter và cộng sự, trích dẫn bởi Levy và cộng sự, 1968.
Tác nhân gây phù chân chuột là carrageenin. Gây phù bằng cách tiêm dƣới da dung dịch carrageenin. Đo thể tích ban bàn chân trƣớc và sau khi tiêm (2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 24 giờ). Tính kết quả trung bình và so sánh.
- Chỉ tiêu quan sát: Chênh lệch thể tích chân chuột.
- Chỉ tiêu đánh giá: Tính mức độ phù chân chuột theo công thức và so sánh giữa các lô thử và lô chứng theo công thức Fontaine.
+ Độ tăng thể tích chân của từng chuột:
Trong đó: Vt: Thể tích chân chuột sau khi gây viêm.
+ Tác dụng chống viêm của thuốc đƣợc đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%):
̅ ̅
̅
Trong đó: ̅ : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô đối chứng. ̅ : Trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô uống thuốc.
̅ : Trung bình thể tích chân chuột trƣớc khi gây viêm. I%: Mức độ ức chế phù [25], [32], [39], [46].
2.2.3.5. Khảo sát tác dụng chống viêm mạn theo phương pháp gây u hạt thực nghiệm
- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng từ 18-22g.
- Phƣơng pháp: Phƣơng pháp gây u hạt trên chuột nhắt trắng bằng amiant theo phƣơng pháp của Ducrot, Julou và cộng sự, (1963).
Vê tròn mẩu sợi amiant và tiệt khuẩn theo quy định. Cấy amiant vào vùng lƣng phía trên của chuột rồi khâu lại. Hàng ngày cho chuột uống thuốc mỗi buổi sáng trong 10 ngày. Tiến hành mổ chuột lấy amiant.
- Chi tiêu quan sát: Trọng lƣợng hạt hạt amiant. - Chỉ tiêu đánh giá: Tính mức độ ức chế sự tạo hạt
̅
̅ Trong đó X%: Mức độ ức chế sự tạo hạt.
m: Khối lƣợng u hạt [25], [32], [39].
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc nhập bằng phần mềm Excel 2007 - Microsolf, xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0. Số liệu đƣợc biểu diễn dƣới dạng SD. Kiểm định các giá trị bằng test t - Student, test t ghép cặp, test ANOVA 2 chiều, test trƣớc sau (Avant- après).
Xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và khoảng tin cậy theo công thức:
Giá trị trung bình: ̅ ∑
Độ lệch chuẩn: √∑ ̅
Sai số chuẩn:
√ √∑ ̅
Khoảng tin cậy: ̅ √
Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn SE: Sai số chuẩn Cl: Khoảng tin cậy n: Số mẫu thí nghiệm k=n-1
tα: Hằng số student với α=0,05.
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH TÍNH ĐÚNG CỦA DƢỢC LIỆU
Chúng tôi tiến hành xác định tính đúng của các dƣợc liệu kim ngân đằng, núc nác, thƣơng nhĩ tử, hòe hoa, đơn lá đỏ, hoàng bá bằng cách mô tả các đặc điểm hình thái và vi học các vị thuốc trên theo tiêu chuẩn DĐVN IV. Các đặc điểm quan sát đƣợc phù hợp với tiêu chuẩn đã đƣợc công bố của các vị thuốc.
3.2. BÀO CHẾ CAO ĐẶC BÀI THUỐC EZ 3.2.1. Bào chế cao sắc nƣớc 3.2.1. Bào chế cao sắc nƣớc
Hình 3.1. Sơ đồ bào chế cao theo phƣơng pháp sắc
- Chuẩn bị dược liệu:
Dƣợc liệu Dƣợc liệu đã làm ẩm Dịch chiết nƣớc Dịch lọc Cao đặc Cô cách thủy Để nguội, lắng, lọc Sắc nóng bằng nƣớc cất Bã dƣợc liệu Rửa sạch, sấy, thấm ẩm
Dƣợc liệu đã đƣợc rửa sạch và sấy ở 60o
C theo tiêu chuẩn của DĐVN IV. Chiết xuất tƣơng đƣơng 15 thang thuốc: Cân khối lƣợng các vị thuốc nhƣ sau: Kim ngân đằng 300g Hòe hoa 150g Thƣơng nhĩ tử 105g Núc nác 225g Đơn lá đỏ 75g Hoàng bá 45g - Chiết xuất:
Các dƣợc liệu đƣợc cân theo đúng khối lƣợng bài thuốc, trộn đều, cho vào ấm đun thuốc Hàn Quốc, thêm lƣợng nƣớc cất gấp 6 lần lƣợng dƣợc liệu. Thấm ẩm trong 30 phút. Bật ấm đun. Sắc nóng trong 1 tiếng. Sắc thuốc 3 lần. Thêm nƣớc để duy trì lƣợng nƣớc không đổi.
Rút dịch chiết, dịch chiết 1 để riêng, dịch chiết 2, 3 gộp chung. Lọc nóng qua vải gạc để loại bỏ tạp chất cơ học. Để nguội, lắng. Lọc dịch lần 2 qua bông để loại tạp không tan.
- Cô cao:
Cô bằng dụng cụ có miệng rộng, cô cách thủy bằng bếp cách thủy, ở nơi thoáng để bay hơi nhanh. Cô dịch chiết 2, 3 trƣớc, dịch chiết 1 sau. Dịch chiết 2, 3 cô đến cao lỏng 1:1 thì phối hợp với dịch chiết 1, tiếp tục cô đến thể chất quy định trong DĐVN IV. Trong quá trình cô chú ý khuấy đảo liên tục để tránh lắng xuống đáy gây cháy khét và tăng khả năng bay hơi.
Kết quả
Kết quả bào chế cao sắc nƣớc đƣợc thể hiện ở bảng sau
Bảng 3.1. Kết quả bào chế cao thuốc theo phƣơng pháp sắc
Khối lƣợng dƣợc liệu (g) Khối lƣợng cao (g) Hiệu suất (%)
900 225,04 25,00
900 220,35 24,48
900 218,41 24,27
Trung bình 221,267 24,58
900g dƣợc liệu (tƣơng đƣơng 15 thang) đầu vào cho ra 221,267g cao có thể tích trung bình 200ml (tức là 1g cao tƣơng đƣơng 4,06g dƣợc liệu hay 1ml cao tƣơng ứng 4,5g dƣợc liệu). Hiệu suất cao: 24,58%.
3.2.2. Bào chế cao chiết ethanol
Hình 3.2. Sơ đồ bào chế cao theo phƣơng phápchiết bằng ethanol
- Chuẩn bị dược liệu, dung môi:
Dƣợc liệu đã đƣợc rửa sạch và sấy ở 60o
C theo tiêu chuẩn của DĐVN IV. Chia nhỏ: Các vị dƣợc liệu đƣợc chia nhỏ đến kích thƣớc phù hợp: xay thô. Chiết xuất tƣơng đƣơng 15 thang thuốc: Cân khối lƣợng các vị thuốc nhƣ sau: Kim ngân đằng 300g Hòe hoa 150g Thƣơng nhĩ tử 105g Núc nác 225g Đơn lá đỏ 75g Hoàng bá 45g
Dung môi chiết ethanol 70%: Ethanol thực phẩm tuyệt đối thêm nƣớc cất vừa đủ để đƣợc ethanol 70%.
Dƣợc liệu
Bột thô dƣợc liệu
Dịch chiết ethanol
Dịch chiết sau thu hồi dung môi
Dịch chiết sau ly tâm Cao lỏng 1:1 Cao đặc Phối hợp các vị, cô cách thủy Ly tâm Cô cách thủy Lắng, lọc, cất thu
hồi dung môi. Ethanol thu hồi
Chiết bằng ethanol 70% Bã dƣợc liệu
Rửa sạch, sấy, xay thô
- Chiết xuất:
Các vị dƣợc liệu đƣợc chiết riêng. Mỗi vị đƣợc cho vào bình cầu có nút mài dung tích 500ml và 1000ml (tùy theo trọng lƣợng vị thuốc), thêm dung môi ethanol 70% gấp 7 lần lƣợng dƣợc liệu. Lắp bình cầu vào sinh hàn. Chiết nóng theo phƣơng pháp hồi lƣu cách thủy trên bếp cách thủy 3 lần, mỗi lần 2 giờ.
Rút dịch chiết sau mỗi 2h, để nguội, lắng, lọc qua bông để loại tạp không tan. Dịch chiết lần 1 đậm đặc để riêng, các dịch chiết lần 2, 3 gộp chung.
Cất thu hồi dung môi ethanol bằng máy cất quay. Ly tâm loại các tạp nhựa lơ lửng trong dịch chiết.
- Cô cao:
Cô riêng từng vị bằng dụng cụ có miệng rộng, cô cách thủy bằng bếp cách thủy, ở nơi thoáng để bay hơi nhanh. Cô dịch chiết 2, 3 trƣớc, dịch chiết 1 sau. Dịch chiết 2, 3 cô trƣớc rồi phối hợp với dịch chiết 1, tiếp tục cô đến cao lỏng 1:1. Gộp các cao của từng vị dƣợc liệu vào tiếp tục cô cách thủy đến khi đạt thể chất theo quy định DĐVN IV. Trong quá trình cô chú ý khuấy đảo liên tục để tránh lắng xuống đáy gây cháy khét và tăng khả năng bay hơi.
Kết quả
Kết quả bào chế cao sắc nƣớc đƣợc thể hiện ở bảng sau
Bảng 3.2. Kết quả bào chế cao thuốc theo phƣơng pháp chiết bằng ethanol
Khối lƣợng dƣợc liệu (g) Khối lƣợng cao (g) Hiệu suất (%)
900 131,06 14,56
900 123,81 13,76
900 141,35 15,70
Trung bình 132,073 14,67
900g dƣợc liệu (tƣơng đƣơng 15 thang) đầu vào cho ra 132,073g cao có thể tích trung bình 90ml (tức là 1g cao tƣơng đƣơng 6,81g dƣợc liệu hay 1ml cao tƣơng ứng 10g dƣợc liệu). Hiệu suất: 14,67%.
Có thể thấy phƣơng pháp bào chế chế cao bằng phƣơng pháp sắc nƣớc cho khối lƣợng cao nhiều hơn phƣơng pháp bào chế bằng chiết ethanol.
Phƣơng pháp sắc nƣớc là phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, thu đƣợc khối lƣợng cao lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp sắc với dung môi nƣớc - dung môi có khả năng hòa tan rộng nên dịch chiết có nhiều tạp chất tan đƣợc trong nƣớc. Điều này dẫn tới nồng độ chất chiết trong dƣợc liệu thƣờng nhỏ.
Trong khi đó, phƣơng pháp chiết ethanol lại có ƣu điểm là loại đƣợc 1 số tạp tan trong nƣớc không tan trong ethanol. Lƣợng cao thu đƣợc ít hơn nhƣng cao thu đƣợc lại có thể chất đặc hơn - nồng độ chất chiết đậm đặc hơn. Tuy nhiên, phƣơng pháp chiết bằng ethanol cần phải qua nhiều công đoạn loại tạp trong đó có chất nhựa (tạp chiếm lƣợng lớn trong các dƣợc liệu đơn lá đỏ, hoàng bá, núc nác, hòe hoa), có thể làm mất nhiều hoạt chất có trong dịch chiết sau mỗi công đoạn lọc, ly tâm hơn phƣơng pháp sắc nƣớc.
Khi chiết xuất và cô cao thành cao đặc, khối lƣợng cao thu đƣợc ít hơn so với cao lỏng hay dịch chiết, thể chất sánh đặc hơn nên dễ bảo quản, vận chuyển và sử dụng hơn thuốc thang, thuận tiện để sản xuất các sản phẩm tiếp theo nhƣ chế thành cao khô hay bào chế dạng viên (nén, nang…) góp phần làm phát triển khu vực ứng dụng và sử dụng của cao thuốc y học cổ truyển.
Một số chỉ tiêu cảm quan, hàm ẩm, pH của cao đặc bài thuốc EZ: - Độ đồng nhất: Cao chiết ethanol và cao sắc nƣớc đều đồng nhất. - Màu sắc: Cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol có màu nâu đen.
- Mùi: Cao chiết ethanol và cao sắc nƣớc có mùi thơm ngọt đắng. - Vị: Cao sắc nƣớc và cao chiết ethanol đều có vị đắng hơi chát. - Hàm ẩm, pH: Cao chiết ethanol: Hàm ẩm: 18,80%, pH: 4,28.
Cao sắc nƣớc: 19,33%, pH: 4,57.
3.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BÀI THUỐC 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm thử 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm thử
Nguyên tắc tính liều: Theo liều phƣơng thuốc cổ truyền là 1 thang thuốc/ngƣời (50kg)/ngày.
Suy ra liều cao đặc bài thuốc cho 1 ngƣời (50kg)/ngày nhƣ sau: - Cao sắc nước: 14,75g cao/ngƣời (50kg)/ngày.
- Cao chiết ethanol: 8,80g cao/ngƣời (50kg)/ngày.
Ngoại suy: Hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tƣơng đƣơng giữa ngƣời và động vật thí nghiệm - chuột nhắt trắng là 12.
Suy ra liều tƣơng đƣơng ngoại suy trên chuột nhắt trắng là: - Liều tương đương tác dụng của cao sắc nước: 3,54g cao/kg TT/ngày. - Liều tương đương tác dụng của cao chiết ethanol: 2,11g cao/kg TT/ngày.