5 '' 6 ''
Hợp chất GG13 được phân lập dưới dạng tinh thể không màu, có đnc. 189- 190oC và độ quay cực [ ]D27 + 30,6o (c 0,17; EtOH).
Phổ khối phân giải cao cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 417,2793[M+H]+ (Hình 4.40.) cho phép xác định công thức phân tử của GG13 là C29H36O2 ( m/z 1,2
O 3 2 1 O 4 5 6 7 8 9 0 1 11 12 13 15 14 1' ' 2 ' 3 ' 4 5' 6' ' 7 '' 1 '' 2 '' 3 4 '' '' 7 H H H H
Hình 4.40. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của GG13 Bảng 4.5. Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG13 Vị trí C, ppm H , ppm, mult, (J, Hz) 1 32,2 2,28 m 2 27,5 2,07 m; 1,36 m 3 36,1 2,63 m; 1,77 m 4 78,3 - 5 35,0 2,07 m 6 29,0 0,37 m 7 27,7 0,65 m 8 17,0 1,86 m; 1,20 m 9 38,5 2,20 m; 1,86 m 10 80,8 - 11 16,7 - 12 16,6 1,00 s 13 29,9 1,10 s ppm ) .
14 20,0 1,14 s 15 22,9 1,24 s 1’ 29,0 2,70 d (9,0) 2’ 122,1 - 3’ 129,3 7,02 m 4’ 119,6 6,82 m 5’ 127,1 7,08 m 6’ 117,0 6,82 m 7’ 153,9 - 1” 31,6 2,63 m; 2,49m 2” 121,9 - 3” 128,9 6,97 m 4” 119,4 6,75 m 5” 127,0 7,02 m 6” 116,9 6,75 m 7” 153,8 -
Phổ UV (EtOH) cho đỉnh hấp thụ ở max nm (log ): 204 (4,53); 219 (4,31); 277 (3,85) và đỉnh hấp thụ ở νmax (cm 1)1610, 1583 trên phổ IR cho thấy sự tồn tại của vòng benzen trong phân tử.
Phân tích phổ 1H-NMR của GG13 (Hình 4.41.)xác nhận sự có mặt 8 proton của hai vòng phenyl thế hai lần ở H 7,08 (1H, m, H-5’); 7,02 (2H, m, H-3’+H-5”); 6,97 (1H, m, H-3”); 6,82 (2H, m, H-4’+H-6’); 6,75 (2H, m, H-4”+H-6”). Bên cạnh đó còn thu được tín hiệu dưới dạng singlet của 4 nhóm methyl ở H 1,24 (3H, s,
Hình 4.41. Phổ 1H-NMR của GG13
Phân tích phổ 13C-NMR với sự trợ giúp của phổ DEPT, HSQC cho thấy sự có mặt của 8 nhóm methin sp2 vòng thơm ở C 153,9; 153,7; 129,3; 128,9; 127,1; 127,0; 119,6; 119,4; 117,0; 116,9; 4 carbon bậc 4 vòng thơm ở C 153,9; 153,7; 122,1; 121,9 trong đó có 2 carbon cho tín hiệu chuyển dịch về trường thấp cho thấy hai carbon này liên kết với oxy (Hình 4.42.). Bên cạnh đó còn có tín hiệu 2 carbon sp3 bậc 3 liên kết với oxy ở
C 80,8; 78,3 và 1 carbon bậc 4 ở C 16,7. Ngoài ra còn có tín hiệu của 4 nhóm methyl ở C 29,9; 22,9; 20,0; 16,6; 6 nhóm methylen sp3 ở C 38,5; 36,1; 31,6; 29,0; 27,5; 17,0 và 4 nhóm methin sp3 ở 35,0; 32,2; 29,0; 27,7
CH 3 - 15) ; 1,14 (3H, s, CH 3 - 14) ; 1,10 (3H, s, CH 3 - 12) và 1,00 (3H, s, CH 3 - 13) .
Hình 4.43. Phổ COSY của GG13 ( Bảng 4.5. ). Hình 4.42. Phổ13 C-NMR và DEPT của GG13
Dựa vào các tín hiệu trên phổ COSY (Hình 4.43.) cho phép xác định các chuỗi liên kết H-1’ H-5 H-6 H-7 H-8 H-9; H-1” H-1 H-2 H-3; 2 vòng phenyl
Hình 4.44. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG13
Trên phổ HMBC (Hình 4.45.) cho thấy tương tác giữa H-1’ với C-2’, C-3’, C7’ chứng tỏ C-1’ liên kết với vòng benzen A qua C-2’; tương tác giữa H-1’ với C-5, C-4; H-5 với C-15 và H-15 với C-3, C-4 cho thấy carbon C-4 liên kết với C-3, C-5 và C-15. Tương tự, tương tác giữa H-1” với C-2”, C-3”, C-7” chứng tỏ vòng benzen B liên kết với C-1” qua C-2”; tương tác giữa H-1” với C-1, C-10 và tương tác giữa H-14 với C-1, C-9, C-10 cho thấy C-10 liên kết với C-1, C-9 và C-14. Tương tác giữa H-12 và H-13 với C-11, C-6, C-7 cho thấy sự liên kết giữa C-11 với H-6 và H7 tạo thành vòng cyclopropan. Việc hình thành vòng cyclopropan với sức căng lớn làm chuyển dịch tín hiệu của proton H-6 và H-7 về trường cao ở H 0,65 (H-7); 0,37 (H-6).
Căn cứ công thức phân tử của GG13 và độ chuyển dịch hóa học của C-4 (78,3), C-10 (80,8), C-7’ (153,9), C-7” (153,7) dịch chuyển về phía trường thấp cho thấy cầu nối oxy giữa C-4 với C-7’; C-10 với C-7” tạo thành các vòng pyran. Như vậy cấu trúc phẳng của GG13 được xác định, thuộc khung bis-benzopyransesquiterpene.
Cấu hình tương đối của GG13 được xác định dựa vào các tương tác trên phổ NOESY (Hình 4.44, 4.46.). Tín hiệu tương tác giữa H-6 với H-7 cho thấy hai proton trong vòng cyclopropan này ở dạng cis. Tương tác giữa CH3-15 với H-6 và tương tác giữa H-5 với CH3-12 và H-1 cho thấy CH3-15 và H-5 ở dạng trans và H-1
Hình 4.46. Phổ NOESY giãn rộng của GG13
cùng phía v ớ i H - 5 .
Hình 4.45. PhổHMBC của GG13
Hình 4.47. Cấu trúc nhiễu xạ tia X của hợp chất GG13
Cấu hình tương đối trên cùng với cấu hình của carbon C-10 được khẳng định qua dữ liệu nhiễu xạ tia X của GG13 cho thấy H-1 và CH3-14 cũng ở dạng trans (Hình 4.47.).
Như vậy cấu trúc của GG13 đã được xác định. Đây là một hợp chất bisbenzopyran-sesquiterpene mới và được đặt tên là gracilipin B.
4.2.2.2 Gracilipin C (GG14)
Hợp chất GG14 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu có độ quay cực [ ]D25 42,9o (c 0,275; EtOH).
Phổ ( )-ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa m/z 309[M-H] và phổ (+)ESI- MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 311[M+H]+. Phổ khối phân giải cao HR-ESI- MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 311,2374[M+H]+ cho phép xác định công thức phân tử của GG14 là C22H30O ( m/z 1,6 ppm).
Phân tích phổ IR, UV, NMRcho thấy GG14 là hợp chất benzopyransesquiterpene tương tự với GG13.
Phổ UV (EtOH) cho đỉnh hấp thụ ở max nm (log ): 205 (4,24); 226 (3,79); 277 (3,31) và đỉnh hấp thụ ở νmax (cm 1)1645, 1554 trên phổ IR cho thấy sự tồn tại của vòng benzen trong phân tử.
Giống như chất GG13, phổ 1H-NMR của GG14 cho thấy sự có mặt của 2 proton của vòng cyclopropan về phía trường cao ở H 0,52 (1H, m, H-7), 0,78 (1H, dd, J= 7,5; 8,0 Hz, H-6). Khác với hợp chất GG13, trên phổ 1H-NMR của GG14 thấy mất đi tín hiệu của 4 proton thuộc 1 vòng phenyl, nhưng lại có thêm tín hiệu của 1 proton olefinic ở H 5,22 (1H, dd, J=4,0; 10,5 Hz, H-1) và 1 nhóm methyl ở 1,61 (3H, s, CH3-14) (Bảng 4.6.).
Phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự có mặt của 4 nhóm methin sp2 vòng thơm ở C 129,9; 126,5; 119,8; 116,2; 2 carbon bậc 4 vòng thơm ở C
155,0; 122,3. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của GG14 còn có tín hiệu của 1 nhóm methin olefinic ở C 127,6; 1 carbon olefinic bậc 4 ở C 131,2; 1 nhóm oxymethin ở C 80,0; 2 nhóm methin sp3 ở C 30,7; 26,8; 4 nhóm methyl ở C 30,5; 21,4; 18,5; 17,7 và 5 nhóm methylen sp2 ở C 39,3; 38,2; 37,7; 23,2; 22,6.
Phân tích phổ COSY cho phép xác định chuỗi liên kết vòng thơm H-3’ H4’ H- 5’ H-6’ và các chuỗi liên kết H-1 H-2 H-3; H-5 H-6 H-7 H-8 H-9 được
Hình 4.48. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG14 Bảng 4.6. Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG14 Vị trí C, ppm H , ppm, mult, (J, Hz) 1 127,6 5,22 dd (4,0; 10,5 Hz) 2 23,2 2,32 m; 2,00 m 3 39,3 1,85 m; 1,59 m 4 36,8 - 5 80,0 3,53 d (6,5 Hz) 6 26,8 0,78 dd (7,5; 8,0 Hz) 7 30,7 0,52 m 8 22,6 1,85 m; 1,08 m 9 38,2 2,07 m; 2,00 m 10 131,2 - 11 18,9 - 12 18,5 1,16 s 13 30,5 1,18 s 14 17,7 1,61 s 15 21,4 0,97 s 1’ 37,7 3,20 d (16,0 Hz); 2,17 d (16,0 Hz) 2’ 122,3 - 3’ 129,9 7,06 m 4’ 119,8 6,83 m 5’ 126,5 7,06 m 6’ 116,2 6,73 m 7’ 155,0 -
Trên phổ HMBC của GG14 cho thấy tương tác giữa H-1’ với C-2’, C-3’, C-7’ chứng tỏ C-1’ liên kết với C-2’ của vòng benzen. Tương tác giữa H-1’ với C-3, C-4, C- 15; CH3-15 với C-3, C-4, C-5; H-6 với C-4 chứng tỏ C-4 liên kết với C-3, C-5, C-1’ và C-15. Tương tác giữa proton của nhóm CH3-14 với C-10, C-1, C-9 và H-1 với C-9 chứng tỏ C-10 liên kết với C-1, C-9, C-14. Tương tác giữa H-6 với C-11, C-12, C-13; CH3-13 với C-11, C-7 chứng tỏ C-11 liên kết với C-6 và C-7 tạo thành vòng cyclopropan với hai nhóm thế methyl. Căn cứ độ chuyển dịch hóa học của C-5 và C-7’
dịch chuyển về phía trường thấp chứng tỏ tồn tại cầu nối oxy giữa C-5 và C-7’ tạo thành vòng pyran. Như vậy cấu trúc phẳng của GG14 được xác định.
Trên phổ NOESY cho thấy tương tác giữa H-6 với H-7 chứng tỏ hai proton này ở dạng cis. Trên vòng pyran, CH3-15 tương tác với H-1’b ( H 2,17) theo kiểu 1,2-axial- equatorial và H-1’a ( H 3,20) tương tác với H-5 theo kiểu 1,3-diaxial cho thấy CH3-15 và H-5 ở dạng trans-diaxial. Bên cạnh đó tương tác giữa H-15 với H-6 cho thấy CH3- 15 và H-6 ở vị trí tương đối như trên Hình 4.48.
Như vậy cấu trúc của GG14 đã được xác định thuộc khung benzopyransesquiterpene và là một hợp chất mới được đặt tên là gracilipin C.
4.2.2.3 Gracilipin D (GG15)
14
Chất GG15 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu có độ quay cực [ ]D25 3,8o (c 0,4; EtOH).
Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 311,2385[M+H]+ cho phép xác định công thức phân tử của GG15 là C22H30O ( m/z 5,1 ppm).
Phổ IR, UV, NMR của GG15 tương tự với hợp chất GG14. Phổ UV (EtOH) cho đỉnh hấp thụ ở max nm (log ): 204 (4,32); 221 (3,89); 277 (3,38) và đỉnh hấp thụ ở νmax (cm 1)1586 trên phổ IR cho thấy sự tồn tại của vòng benzen trong phân tử.
Phân tích phổ 1H-NMR của GG15 cho thấysự có mặt 4 proton của 1 vòng phenyl thế hai lần ở H 7,08 (1H, m, H-5’); 7,00 (1H, br d, J=7,5 Hz, H-3’); 6,80 (2H, m, H- 4’+H-6’). Bên cạnh đó còn thu được tín hiệu dưới dạng singlet của 3 nhóm methyl ở
H 1,32 (3H, s, CH3-12); 1,07 (3H, s, CH3-13); 1,04 (3H, s, CH315). Khác với hợp chất O 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 1 2 3 4 5 6 7 8 15 13 12 11 10 9 H H H
GG14, trên phổ 1H-NMR của GG15 có thêm tín hiệu doublet của 1 nhóm methyl ở H 0,84 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-14) (Bảng 4.7.). Bảng 4.7. Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) của GG15 Vị trí C, ppm H , ppm, mult, (J, Hz) 1 51,8 2,35 m 2 17,1 1,65 m 3 35,7 1,69 m 4 39,1 - 5 87,5 - 6 27,7 0,59 d (10,0 Hz) 7 30,0 0,76 m 8 24,7 1,96 m; 1,44 m 9 32,8 1,55 m; 1,44 m 10 34,2 1,88 m 11 21,4 - 12 17,4 1,32 s 13 30,8 1,07 s 14 22,3 0,84 d (7,0 Hz) 15 22,4 1,04 s 1’ 38,9 2,90 d (16,5 Hz); 2,47 d (16,5 Hz) 2’ 120,3 - 3’ 129,8 7,00 br d (7,5 Hz) 4’ 119,1 6,80 m 5’ 127,0 7,08 m 6’ 116,1 6,80 m 7’ 153,0 -
Phân tích phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy sự có mặt của 4 nhóm methin sp2 vòng thơm ở C 129,8; 127,0; 119,1; 116,1; 2 carbon bậc 4 vòng thơm ở C
153,0; 120,3. Ngoài ra trên phổ 13C-NMR của GG15 còn có tín hiệu của 4 nhóm methin sp3 ở C 51,8; 34,2; 30,0; 27,7; 3 carbon sp3 bậc 4 ở 87,5; 39,1; 21,4 trong đó có 1
carbon bậc 4 liên kết với oxy có độ chuyển dịch hóa học dịch chuyển về trường thấp và 5 nhóm methylen sp3 ở C 38,9; 35,7; 32,8; 24,7; 17,1.
Phân tích phổ COSY cho phép xác định chuỗi liên kết vòng thơm H-3’ H- 4’ H-5’ H-6’ và các chuỗi liên kết H-1 H-2 H-3; H-5 H-6 H-7 H-8 H-9 H-
Hình 4.49. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC, NOESY của GG15
Trên phổ HMBC của GG15 cho thấy tương tác giữa H-1’ với C-2’, C-3’, C-7’ chứng tỏ C-1’ liên kết với C-2’ của vòng benzen. Tương tác giữa H-1’ với C-3, C-4, C- 15, C-3; CH3-15 với C-3, C-4, C-5; H-6 với C-4, C-5 chứng tỏ C-4 liên kết với C-3, C- 5, C-1’ và C-15. Tương tác giữa proton của nhóm CH3-14 với C-10, C-1 chứng tỏ C- 10 liên kết với C-1. Tương tác giữa H-6 với C-11, C-12, C-13; CH3-12 với C-11, C-7 chứng tỏ C-11 liên kết với C-6 và C-7 tạo thành vòng cyclopropan với hai nhóm thế methyl. Tương tác giữa H-2 với C-1 và C-5 chứng tỏ C-1 liên kết với C-5 tạo thành vòng cyclopentan. Căn cứ độ chuyển dịch hóa học của C-5 và C7’ dịch chuyển về phía trường thấp chứng tỏ tồn tại cầu nối oxy giữa C-5 và C-7’ tạo thành vòng pyran. Như vậy cấu trúc phẳng của GG15 được xác định.
Trên phổ NOESY cho thấy tương tác giữa H-6 với H-7 chứng tỏ hai proton này ở dạng cis. Bên cạnh đó tương tác giữa CH3-15 với H-6 cho thấy CH3-15 và H6 ở vị trí tương đối như trên Hình 4.49. Cấu hình tương đối của C-1 và C-10 được xác định dựa trên tín hiệu tương tác giữa H-1 với H-1’a ( H 2,90) trong khi CH3-15 tương tác với H- 1’b ( H 2,47); CH3-14 tương tác với H-9a ( H 1,55) trong khi đó H-
Như vậy cấu trúc của GG15 được xác định, thuộc khung benzopyransesquiterpene và là một hợp chất mới được đặt tên là gracilipin D.
4.2.2.4 Squalene (GG16)
Hợp chất GG16 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 411 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C30H50.
Phân tích phổ 13C-NMR, DEPT và kết hợp với phổ khối lượng cho thấy 15 tín hiệu tương ứng với 8 nhóm methyl, 10 nhóm methylen, 6 nhóm methin và 6 carbon bậc 4. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 6 nhóm methyl dưới dạng singlet ở H 1,60 (18H, s, 6 x CH3), 2 nhóm methyl ở H 1,68 (6H, s, 2 x CH3). Ngoài ra trên phổ 1HNMR còn có tín hiệu của 10 nhóm methylen ở H 1,96-2,10 (20H, m, 10 x CH2) và 6 nhóm methin vinylic ở H 5,08-5,15 (6H, m, 6 x CH). Từ các dữ liệu phổ NMR và so sánh với tài liệu đã được công bố [105], cho phép xác định chất GG16 là squalene.. Đây là một tiền chất trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol, được sử dụng trong y học làm chất nhũ tương, chất dẫn thuốc cho vaccine, thuốc điều trị ung thư, ... và còn có tác dụng phòng ngừa ung thư [106].
4.2.2.5 Benzyl benzoate (GG17)
Hợp chất GG17 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 235 [M+Na]+ tương ứng với công thức phân tử C14H12O2. Phổ UV của GG17 cho các dải hấp thụ đặc trưng của một esther thơm ở max nm (log ) (EtOH): 206 (4,12); 230 (4,17); 272 (2,97). Phân tích phổ 13C-
NMR và DEPT của GG17 cho thấy sự có mặt của 14 nguyên tử carbon trong phân tử, gồm 1 nhóm carbonyl ester ở C 166,4 (C=O), 10 carbon methin vòng thơm ở C 133,0 (C-4); 129,7 (C-2+C-6); 128,6 (C-3+C-5); 128,4 (C-4’); 128,1 (C-2’+C-6’); 2 carbon bậc 4 ở C 136,1 (C-1’); 130,1 (C-1) và 1 nhóm oxymethylen ở C 66,7 (CH2O).
Trên phổ 1H-NMR của GG17 có tín hiệu của 10 proton methin vòng thơm ở H
8,10 (2H, br d, J = 8,0 Hz, H-6+H-2); 7,35- 7,79 (8H, m, H-3 H-5, H-2’ H-6’). Nhóm methylen gắn với oxi cho tín hiệu singlet ở H 5,39 (2H, s, CH2). Từ các dữ kiện phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép kết luận chất GG17 chính là benzyl benzoate [107].
4.2.2.6 Acid benzoic (GG18)
Hợp chất GG18 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Phổ khối phun mù điện tử ( )ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa ở m/z 121 [MH] và (+)ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở m/z 123 [M+H]+ phù hợp với công thức phân tử C7H6O2. Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho các nhóm chức ở max
3060 cm 1 (OHacid), 1682 cm 1 (carbonyl acid). Phổ UV của GG18 cho các đỉnh hấp thụ đặc trưng của một acid thơm ở max nm (log ) (EtOH): 228 (4,10); 272 (2,96).
Phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của GG18 cho thấy phân tử có 7 nguyên tử carbon, trong đó có 1 nhóm carbonyl acid ở C 172,3 (C=O), 5 carbon methin vòng thơm ở C 128,5 (C-3 + C-5); 130,2 (C-2 + C-6); 133,8 (C-4) và 1 carbon bậc 4 ở C
129,4 (C-1). Trên phổ 1H-NMR, xuất hiện tín hiệu của 5 proton methin vòng thơm ở
H 7,49 (2H, t, J=8,0 Hz, H-3 + H-5); 7,62 (1H, t, J=8,0 Hz, H-4) và 8,14 (2H, dd,
J=1,0; 8,0 Hz, H-2 + H-6). Từ các dữ kiện phổ NMR và so sánh với tài liệu tham khảo