Hợp chất GM13 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim không màu, có đnc. 141-143 oC và độ quay cực [ ]D20+195,7o (c 0,3; EtOH). Phổ 1H-NMR, 13CNMR, UV của GM13 gần giống với hợp chất altholactone (GM1, (16)). Phổ khối phun mù điện tử cho pic ion giả phân tử [M+Na]+m/z 297 phù hợp với công thức phân tử C15H14O5
(M = 274) và tín hiệu của 15C quan sát thấy trên phổ 13C-NMR. Sự có mặt của hai nhóm carbonyl trong phân tử được đặc trưng bởi các tín hiệu ở δC 160,4 ( -lactone-
,β-không no); 169,4 (OAc) trên phổ 13C-NMR và các đỉnh hấp thụ trên phổ IR ở max
1743, 1724 cm 1. Sự có mặt của nhóm acetyl còn được đặc trưng bởi tín hiệu singlet của nhóm methyl ở δH 2,16 (3H, s, CH3), δC 20,8 (CH3) và sự chuyển dịch về trường thấp của tín hiệu proton H-7: δH 5,40 (1H, br d, J=3,5 Hz, H-7) đối với GM13 và δH
4,42 (1H, m, H-7) đối với altholactone (GM1).
Phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy sự có mặt của nhóm phenyl với tín hiệu của 5 proton tại H 7,30-7,36 (5H, m, C6H5) và tín hiệu của các carbon sp2 vòng
thơm ở C 137,5 (C-9); 128,7 (C-11+C-13); 128,5 (C-12); 126,2 (C-10+C-14). Tín hiệu của 4 nhóm oxymethin cũng được quan sát thấy trên phổ 13C-NMR ở C 86,1 (C-8); 83,6 (C-6+C-7); 69,1 (C-5). Hai proton olefinic thuộc vòng lactone cho tín hiệu đặc trưng ở H 7,03 (1H, dd, J=5,5; 10,0 Hz; H-4); 6,28 (1H, d, J=10,0 Hz, H-3) cùng với tín hiệu của carbon sp2 tương ứng ở C 139,1 (C-4); 124,7 (C-3).
Hình 4.18. Một số tương tác chính trên phổ HMBC, COSY và NOESY của GM13
Cấu hình tương đối của GM13 được xác định dựa trên hằng số tương tác của các proton trên vòng furan và tương tác trên phổ NOESY. Hằng số tương tác JH5-H6 = 4,0 Hz cho thấy H-5 và H-6 ở dạng cis; JH6-H7 = 1,0 Hz và JH7-H8 = 3,5 Hz cho phép xác định mối tương quan trans giữa H-6 và H-7; H-7 và H-8 [33]. Ngoài ra, cấu hình cis giữa H-5 và H-6 còn đươc khẳng định nhờ tương tác giữa hai proton này trên phổ NOESY (Hình 4.18.). Từ các dữ kiện phổ UV, IR, 1H-, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC, giá trị độ quay cực và so sánh với tài liệu tham khảo [33] cho phép xác định cấu trúc của chất
GM13 là 7-acetylaltholactone.
4.1.2.4 Annonacin (GM14)
Hợp chất GM14 được phân lập dưới dạng chất rắn dạng sáp màu trắng có độ quay cực [ ]D25 +16o (c 0,40; MeOH). Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 619,4544 [M+Na]+ cho phép xác định công thức phân tử của GM14 là C35H64O7 ( m/z 0,0 ppm). Phổ UV cho đỉnh hấp thụ ở 211 nm (log 3,82; EtOH) và
phổ IR cho đỉnh hấp thụ ở 1744 cm 1 đặc trưng cho vòng -lactone-α,βkhông no có trong nhiều hợp chất acetogenin họ Na [11]. Nhận định này được khẳng định qua các tín hiệu quan sát được trên phổ 1H-NMR ở H 7,18 (1H, br s, H33); 5,05 (1H, q, J=6,8 Hz, H-34); 2,51 (1H, m, H-3a); 2,42 (1H, m, H-3b); 1,43 (3H, d, J=7,0 Hz, CH3-35) và
các tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở C 174,6 (C-1); 151,8 (C-33); 131,2 (C-2); 78,0 (C- 34); 33,4 (C-3); 19,1 (C-35). Cấu trúc vòng lactone được khẳng định nhờ chuỗi liên kết H-33 H-34 H-35 thu được trên phổ COSY và tương tác giữa H-34 với C-35, C-2, C-1, C-33; H-3 với C-2, C-1, C-33 quan sát được trên phổ HMBC cho thấy vòng - lactone không no liên kết với C-3 qua C-2 (Hình 4.19.).
Hình 4.19. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM14
Trên phổ 13C-NMR của GM14 còn cho tín hiệu của 4 nhóm oxymethin ở C 74,1 (C-15); 74,0 (C-20); 71,8(C-10); 69,9 (C-4) cho thấy sự tồn tại của 4 nhóm hydroxyl bậc hai trong phân tử. Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR ở H 3,79 (2H, dd, J=7,0; 13,5 Hz, H-16+H-19) và 3,41 (2H, m, H-15+H-20) cùng với tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở
C 82,7 (C-16); 82,6 (C-19) và 74,1 (C-15); 74,0 (C-20) chứng minh sự tồn tại vòng THF với hai nhóm OH kề bên đều ở cấu hình threo theo mô
Căn cứ độ chuyển dịch hóa học của các proton trong hai nhóm methylen trong vòng THF ở H 1,97 (2H, m, H-17a+H-18a) và 1,65 (2H, m, H-17b+H-18b) và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu hình vòng THF là trans [81]. Như vậy vòng THF và 2 nhóm OH kề bên có cấu hình tương đối threo/trans/threo.
Khi phân tích phổ MS/MS sử dụng muối lithium ion hóa phân tử của acetogenin; B.C Das đã thu được các ion đặc trưng có chứa vòng lactone (kí hiệu A, B, C), các ion chứa nhóm methyl cuối mạch (kí hiệu X, Y, Z). Trong đó các ion A và X tạo thành do sự phân cắt α đối với nhóm OH và chứa nguyên tử O của nhóm này; các ion B và Y tạo thành do sự phân cắt qua vòng THF; các ion C và Z tạo thành do sự phân cắt α đối với vòng THF. Từ các ion đặc trưng này cho phép xác định cấu trúc của các acetogenin [66].
Vị trí của các nhóm OH tại C-4, C-10, C-15, C-20 và vị trí vòng THF tại C-16 và C-19 của hợp chất GM14 được xác định dựa vào các ion mảnh thu được trên phổ khối phân giải cao sàng lọc ion gắn thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao và sử dụng muối lithium ion hóa phân tử HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap, HPLC-Li-(+)ESIQTOF. Sơ đồ phân mảnh của GM14 được trình bày trên Hình 4.19.
Theo phương pháp HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap, pic cơ bản trong phổ MS/MS của GM14 tương ứng với ion mảnh X4 ([M+Li-112]+, m/z 491,42807;
Hình 4.21. Phổ Li-(+)ESI-LQT/Obitrap MS/MS của GM14
Ngoài ra trên phổ MS/MS còn thu được các ion mảnh [M+Li-CO2]+, [M+LiCO2- H2O]+, [X4-H2O]+. Ion mảnh [B1-2H-H2O]+ (m/z 341,23050; C20H30O4Li) tương ứng với sự phân cắt qua vòng THF cũng được quan sát thấy trên phổ MS/MS
OH liên k ế t v ớ i nguyên t ử C - 4 [82] ( Hình 4.21. ) .
Theo phương pháp HPLC-Li-(+)ESI-QTOF, ngoài các ion mảnh X4 (m/z
491,4269; C29H56O5Li) thu được như phương pháp HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap còn thu được các ion mảnh X3 (m/z 391,3385; C23H44O4Li), A3 (m/z 247,1873; C13H20LiO4), [A3-CO2] (m/z 203,1609; C12H20LiO2) cho phép xác định vị trí nhóm OH ở C-10. Vị trí vòng THF ở C-16, C-19 và các nhóm OH ở C-15, C-20 được xác định qua tín hiệu của các ion mảnh Z2 (m/z 275,2544; C17H32O2Li); X2 (m/z
Hình 4.23. Một số ion mảnh trên phổ Li-(+)ESI-QTOF MS/MS của GM14
Như vậy vị trí vòng THF, nhóm OH trong phân tử GM14 đã được xác định. Từ các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, HRMS, MS/MS và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định GM14 là Annonacin. Đây là hợp chất mono-THF-acetogenin được phân lập lần đầu tiên từ loài Annona densicoma
(Annonaceae) vào năm 1987 [83].
4.1.2.5 cis+trans-Solamin (GM15)
305,2660 ; C 18 H 34 O 3 Li); X 1 ( m/z 205,2145 ; C 13 H 26 OLi) ( Hình 4.23. ) .
Hợp chất GM15 được phân lập dưới dạng chất bột rắn màu trắng có độ quay cực [ ]D25 +20o (c 0,30; MeOH). Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 587,4640 [M+Na]+ cho phép xác định công thức phân tử của
GM15 là C35H64O5 ( m/z 1,0 ppm). Phân tích các dữ kiện phổ IR, UV, NMR cho thấy
hợp chất GM15 là một mono-THF-acetogenin tương tự hợp chất GM14. Vòng - lactone không no trong phân tử GM15 được đặc trưng bởi đỉnh hấp thụ ở 208 nm (log
4,79; EtOH) trên phổ UV, đỉnh hấp thụ ở 1741 cm 1 trên phổ IR và các tín hiệu quan sát được trên phổ 1H-NMR ở H 6,98 (1H, d, J=1,5 Hz; H-33); 4,99 (1H, dq, J=1,8; 6,8 Hz; H-34); 2,26 (2H, t, J=7,8 Hz; H-3); 1,40 (3H, d, J=7,0 Hz; CH335) cùng với các tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở C 173,9 (C-1); 148,9 (C-33); 134,3 (C-2); 77,4 (C-34); 25,2 (C-3); 19,2 (C-35). Cấu trúc vòng -lactone được khẳng định nhờ chuỗi liên kết H- 33 H-34 H-35 được xác định trên phổ COSY và các tương tác giữa H-34 với C-35, C-2, C-1, C-33; H-3 với C-2, C-1, C-33 quan sát được trên phổ HMBC cho thấy vòng
-lactone không no liên kết với C-3 qua C-2 (Hình 4.24.).
Tín hiệu triplet của hai proton tương đương tại H 2,26 (2H, t, J=7,8 Hz; H-3) cho thấy tại carbon C-4 không có nhóm OH. So với hợp chất GM14, GM15 ít hơn hai nhóm hydroxyl ở C-4 và C-10. Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR ở H 3,80 (2H, m,
Hz, H-16+H-19) và 3,41 (2H, m, H-15+H-20) cùng với tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở
C 82,7 (C-16); 82,6 (C-19) và 74,4 (C-15); 74,1 (C-20) cho thấy sự tồn tại vòng THF với hai nhóm OH kề bên đều ở cấu hình threo theo mô hình của Fujimoto tương tự với hợp chất GM14 [80]. Chuỗi liên kết từ H-14 đến H-21 cũng được quan
Hình 4.24. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM15
Trên phổ 1H-NMR của GM15 xuất hiện các tín hiệu của proton vòng THF ở hai nhóm H 1,98 (2H, m, H-17a+H-18a) và 1,68 (2H, m, H-17b+H-18b) tương ứng với vòng THF ở cấu hình trans và tín hiệu ở H 1,95 (2H, m, H-17a+H-18a); 1,74 (2H, m, H-17b+H-18b) tương ứng với vòng THF ở cấu hình cis [81]. Điều này cho thấy GM15
ở dạng hỗn hợp hai đồng phân cis và trans. Nhận định này được khẳng định qua phân tích phổ HPLC-Li-(+)ESI-QTOF thu được hai pic ở RT 31,784 và 32,080 min (Phụ lục 15.) và các ion [M+Li]+, ion mảnh tương ứng hoàn toàn trùng nhau cho thấy GM15 là hỗn hợp của hai đồng phân lập thể.
Khác với hợp chất GM14, trong phương pháp HPLC-Li-(+)ESILTQ/Orbitrap, pic cơ bản trên phổ MS/MS của ion [M+Li]+ của GM15 là [M+LiCO2]+ (m/z 527,50110; C34H64O3Li) trong khi đó ion tương ứng với sự mất đi số khối 112 ([M+Li-112]+m/z
459,43826; C29H56O3Li) có cường độ tương đối rất yếu (Phụ lục 15.) cho thấy vị trí C- 4 không có nhóm OH [66]. Trên phổ MS/MS của GM15 còn cho pic m/z 473,4541 (C30H58O3Li) tương ứng với sự phân cắt vòng lactone ở vị trí C-2.
Các tín hiệu trên phổ HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap MS/MS của GM15 cũng được quan sát thấy trên phổ HPLC-Li-(+)ESI-QTOF. Ngoài ra trên phổ QTOFMS/MS của GM15 còn cho các ion mảnh ở m/z 459,4396 (C29H56O3Li, “X4”) tương ứng với sự
phân cắt liên kết C-3 và C-4. Vị trí vòng THF tại C-16, C-19 và các nhóm OH tại C-15, C-20 được xác định qua các ion mảnh B1 (m/z 329,2661;
C20H34O3Li); X1 (m/z 205,2139; C13H26OLi); X2 (m/z 305,2672; C18H34O3Li); Y1 (m/z
235,2247; C14H28O2Li); Z2 (m/z 275,2565; C17H32O2Li). Như vậy vị trí vòng THF, nhóm OH trong phân tử GM15 đã được xác định. Từ các dữ kiện phổ NMR,
HRMS, MS/MS và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định GM15 là
cis+trans-Solamin [84],[85]. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được sử dụng phương pháp HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap, HPLC-Li-(+)ESI-QTOF để xác định cấu trúc.
4.1.2.6 Isoannonacin (GM16)
Hợp chất GM16 được phân lập dưới dạng chất bột rắn màu trắng có độ quay cực [ ]D25 +20o (c 0,28; MeOH). Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 619,4544 [M+Na]+ cho phép xác định công thức phân tử của
GM16 là C35H64O7 ( m/z 0,0 ppm). Phân tích phổ NMR cho thấy GM16 là một mono- THF-acetogenin. Khác với hợp chất GM14, GM15; trong phân tử GM15 chứa vòng ketolactone đầu mạch. Phổ IR cho đỉnh hấp thụ ở 1704, 1766, cm 1 tương ứng với vòng -lactone và nhóm ketone. Phân tích phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu ở H 4,54 (1H, m, H-4); 3,02 (2H, m, H-2+H-33a); 2,66 (1H, dd, J=9,8; 19,3 Hz, H-33b); 2,22 (1H, ddd,
J=3,3; 9,8; 13,0 Hz, H-3a); 1,98 (1H, m, H-3b) và 2,19
(3H, s, CH3-35) cùng với tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở C 205,5 (C-34); 178,8 (C1); 78,9 (C-4); 44,2 (C-33); 34,5 (C-2); 33,3 (C-3); 29,9 (C-35) đặc trưng cho vòng ketolactone ở dạng trans có trong phân tử nhiều hợp chất acetogenin đã được phân lập từ họ Na (Hình 4.25.) [53].
Hình 4.25. Độ chuyển dịch hóa học của proton trong vòng ketolactone
Cấu trúc vòng ketolactone trong phân tử GM16 còn được khẳng định nhờ các tương tác trên phổ COSY cho phép xác định chuỗi liên kết H-5 H-4 H-3 H-2 H33. Trên phổ HMBC quan sát thấy tín hiệu tương tác giữa H-35 với C-34 và C-33 cho thấy mối liên kết giữa C-34 và C-33; ngoài ra còn có tương tác giữa H-3 với C-
Hình 4.26. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM16
Tương tự với hợp chất GM14, GM15; trong phân tử GM16 cũng có 1 vòng THF với 2 nhóm hydroxyl kề bên được đặc trưng bằng các tín hiệu trên phổ 1HNMR và 13C-NMR. Tín hiệu trên phổ 1H-NMR ở H 1,98 (2H, m, H-17a+H-18a) và
1,68 (2H, m, H-17b+H-18b) cho thấy vòng THF ở dạng cấu hình trans. Tín hiệu ở H
3,79 (2H, dd, J=6,5; 13,5 Hz, H-16+H-19) và 3,40 (2H, m, H-15+H-20) trên phổ 1H- NMR và tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở C 82,7 (C-16); 82,6 (C-19); 74,1 (C15); 74,0
(C-20) đặc trưng cho 2 nhóm OH bên cạnh vòng THF ở vị trí threo/threo. Bên cạnh đó chuỗi liên kết từ H-15 đến H-20 cũng được quan sát thấy trên phổ COSY. Ngoài các tín hiệu đặc trưng của vòng THF với 2 nhóm OH kề bên và vòng ketolactone; trên phổ 13C- NMR của GM16 còn có tín hiệu của 1 nhóm oxymethin ở C 71,7 (C-10) cho thấy C- 10 liên kết với OH.
Vị trí của các nhóm OH và vòng THF trong phân tử GM16 được xác định qua các ion mảnh đặc trưng B1-2H (m/z 359,2408; C20H32O5Li), B1-2H-H2O (m/z 341,2296; C20H30O4Li), ion tương ứng sự phân cắt qua vòng lactone m/z 489,4487 (C30H58O4Li) theo phương pháp Orbitrap và các ion mảnh A3-CO2 (m/z 203,1603; C12H20O2Li); X1
(m/z 205,2142; C13H26OLi), X2 (m/z 305,2673; C18H34O3Li), X3 (m/z 391,3387; C23H44O4Li), Z2 (m/z 275,2551; C17H32O2Li); Z3 (m/z 361,3276; C22H42LiO3) theo phương pháp QTOF. Sơ đồ phân mảnh của GM16 được trình bày trên Hình 4.26.
Như vậy cấu trúc của GM16 đã được xác định chính là Isoannacin, phù hợp với tài liệu tham khảo [48]. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được sử dụng phương pháp HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap, HPLC-Li-(+)ESI-QTOF để xác định cấu trúc.
4.1.2.7 trans-Murisolinone (GM17)
Hợp chất GM17 được phân lập dưới dạng chất bột rắn màu trắng có độ quay cực [ ]D25 +25o (c 0,42; MeOH). Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 603,4585 [M+Na]+ cho phép xác định công thức phân tử của GM17 là C35H64O6 ( m/z 1,7 ppm). Các dữ liệu phổ IR, UV, NMR của GM17 gần giống với hợp chất GM16 là một mono-THF-acetogenin với vòng ketolactone đầu mạch.
Vòng ketolactone được đặc trưng bằng các dữ liệu phổ UV với đỉnh hấp thụ
maxEtOH nm (log ): 202 (2,50) và đỉnh hấp thụ ở 1711 cm 1 trên phổ IR cùng với đỉnh hấp thụ của nhóm ketone ở 1743 cm 1. Cấu hình tương đối của vòng ketolactone ở dạng trans được đặc trưng bằng các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13CNMR: H 4,54 (1H, m, H- 4); 3,02 (2H, m, H-2+H-33a); 2,66 (1H, dd, J=9,5; 19,0 Hz, H-33b); 2,23 (1H, ddd,
J=3,3; 9,5; 13,0 Hz, H-3a); 1,98 (1H, m, H-3b) và 2,19 (3H, s, CH3-35); C 205,5 (C- 34); 178,8 (C-1); 78,9 (C-4); 44,3 (C-33); 34,5 (C-2); 33,3 (C-3); 29,9 (C-35).
Tương tự với hợp chất GM16; trong phân tử GM17 cũng có 1 vòng THF với 2 nhóm hydroxyl kề bên được đặc trưng bằng các tín hiệu trên phổ 1H-NMR và
13CNMR. Tín hiệu trên phổ 1H-NMR ở H 1,98 (2H, m, H-17a+H-18a) và 1,68 (2H, m, H-17b+H-18b) cho thấy vòng THF ở dạng cấu hình trans. Tín hiệu ở H 3,80 (2H, dd,
J=6,5; 13,5 Hz, H-16+H-19); 3,40 (2H, br d, J=6,5 Hz; H-15+H-20) trên phổ 1H-NMR và tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở C 82,7 (C-16+C-19); 74,0 (C-15+C-20)
Hình 4.27. Một số tương tác chính trên phổ COSY, HMBC và phân mảnh MS/MS của GM17
Phân tích phổ NMR của GM17 cho thấy chỉ có các tín hiệu đặc trưng của vòng ketolactone, vòng THF với 2 nhóm OH kề bên; còn lại là các nhóm methylen bão hòa. Như vậy so với GM16,GM17 không có nhóm hydroxyl ở C-10. Điều này được khẳng định trên phổ Obitrap, QTOF của GM17 không có ion mảnh X3 ở số khối m/z 391. Cấu trúc các vòng THF, ketolactone cũng được khẳng định qua phân tích phổ COSY, HMBC (Hình 4.27.).
B1-2H (m/z 343,24597; C20H32O4Li), B1-2H-CO2 (m/z 299,25617; C19H32O2Li), ion tương ứng sự phân cắt qua vòng lactone m/z 473,45425 (C30H58O3Li) trên phổ Obitrap và các ion mảnh X1 (m/z 205,2113; C13H26OLi), X2 (m/z 305,2670; C18H34O3Li), Z2
(m/z 275,2537; C17H32O2Li) trên phổ QTOF. Sơ đồ phân mảnh của GM17 được trình bày trên Hình 4.27.
Từ các dữ liệu phổ NMR, IR, UV, HRMS, HR-MS/MS cấu trúc của GM17 được xác định là trans-Murisolinone; phù hợp với lài liệu tham khảo [86].
Đây là lần đầu tiên hợp chất này được sử dụng phương pháp HPLC-Li- (+)ESILTQ/Orbitrap, HPLC-Li-(+)ESI-QTOF để xác định cấu trúc.
4.1.2.8 β-Caryophyllene oxide (GM18)
Hợp chất GM18 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu có độ quay cực [ ]D24 57,6o (c 0,63; CHCl3). Phổ IR cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của liên kết đôi ở
max 1627 cm 1. Phổ khối phun mù điện tử ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ở
m/z 221 [M+H]+ phù hợp với công thức phân tử C15H24O.