2.1.1. Môi trƣờng, hoá chất, dung môi, thiết bị
2.1.1.1. Môi trường
- Môi trường BSM đặc (Fluka) lô BCBK6505V.
Hỗn hợp kháng sinh để thêm vào môi trường BSM đặc, lô BCBK 1651V - Môi trường MRS đặc (Merck)
Công thức
Pepton 10,0g
Cao thịt 8,0g Cao men bia 4,0g
Glucose 20,0g Dikali hydrophosphat 2,0g Tween 80 1,0g Amoni citrat 2,0g Natri acetat 5,0g Mangan sulfat 0,04g Magnesi sulfat 0,2g Thạch 14,0g Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 5,7 ± 0,2
- Môi trường MRS lỏng (Merck) có công thức giống môi trường MRS đặc chỉ khác là không có thạch.
21
- Môi trường API 20A (BioMérieux, Pháp): Ống 4ml. Số lô: 1002717340. Hạn dùng: 5/5/2015
Công thức
Trypticase 5,0g
Cao men bia 5,0g Natri clorid 2,5g L-tryptophan 0,2g L-cystine 0,4g Hemin 0,005g Vitamin K1 0,01g Natri sulfit 0,1g Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 6,9 – 7,3. - Môi trường thạch máu
Công thức Pepton 10,0g Natri clorid 5,0g Cao thịt 2,5g Thạch 20,0g Nước cất vừa đủ 1000ml pH sau khi tiệt trùng: 7,4 – 7,6
22
2.1.1.2. Hoá chất, dung môi
- Hóa chất, dung môi được ghi ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2 Bảng 2.1. Mồi đặc hiệu
Loài Tên mồi Số lô Hãng sản xuất
Đoạn 16S rDNA ID16R08F 208918A07 Invitrogen IDL16R09R 208918A08 B. longum BlonF 208918B05 Invitrogen BlonR 208918B05
VectorpGemT easy nguyên bản
Promega
Bảng 2.2. Hóa chất, dung môi
Tên Số lô Hãng sản xuất
Lysozym 061M13281V Sigma-Aldorich WizardR Genomic DNA
Purification Kit
297885 Promega
Taq DNA polymerase 1130853 Life technologies dNTPs (100mM) 1139131 Life technologies
Thang DNA chuẩn 668361 Invitrogen
DNA loading Dye (6X) 00056239 Fermentas Đệm PCR – MgCl2 (10X) 1113366 Invitrogen Nước cất siêu tinh khiết 764952 Invitrogen Agarose siêu tinh khiết 0000144547 Invitrogen Tris siêu tinh khiết 90920S196 Biobasic Inc
EDTA, free acid 1004SHLS0125B0210J Biobasic Inc Kit API 20A 1002998430 BioMérieux Thuốc thử BCP 1003101450 BioMérieux
Thuốc thử XYL Merck
23
- Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút chính xác 2,0ml dung dịch bari clorid 1,0% vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0% vừa đủ đến vạch, trộn đều.
- Độ đục chuẩn McFarland số 3: Hút chính xác 3,0ml dung dịch bari clorid 1,0% vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 1,0% vừa đủ đến vạch, trộn đều.
Đo độ hấp thụ của các độ đục chuẩn ở bước sóng 600nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 1,0% làm mẫu trắng thì độ hấp thụ của độ đục chuẩn số 2 khoảng 0,451, độ hấp thụ của độ đục chuẩn số 3 khoảng 0,582. Độ đục chuẩn chỉ dùng trong vòng 3 tháng kể từ ngày pha.
2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ
a. Thiết bị.
Được hiệu chuẩn theo ISO/IEC-17025 và GLP. - Buồng thổi khí sạch Kebo (Thuỵ Điển). - Tủ ấm CO2 T 305-F (Thuỵ Điển)
- Tủ sấy Memmert ULE 600 (Đức) - Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật)
- Cân kĩ thuật điện tử Sartorius TE 412, độ chính xác 0,01g (Đức) - Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Shimadzu (Nhật Bản)
- Tủ lạnh sâu Kebo 2951 (Thuỵ Điển) - Máy li tâm lạnh Mikro-200R (Đức) - Máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 (Mỹ) - Máy chụp ảnh gel UVDI- 312 (Đài Loan)
- Máy khuyếch đại gen RealTime Step one Plus (Singapore) - Máy lắc trộn Vortex Genie 2 (Mỹ)
- Đèn soi UV ở bước sóng 365nm b. Dụng cụ
Các dụng cụ thuỷ tinh như pipet, bình định mức, bình nón... Class A. Micropipet (Eppendorf - Đức) 10 l, 100 l 1000 l, 5ml và 10ml. Ống nhựa 1,5ml, 2,0ml; ống thủy tinh kích thước 16x120mm.
24
2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux.
2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn
Các chủng vi sinh vật chuẩn được sử dụng trong đề tài này được trình bày ở
Bảng 2.3
Bảng 2.3. Các vi sinh vật chuẩn được sử dụng
TT Tên chủng Kí hiệu TT Tên chủng Kí hiệu
1 Bacillus cereus ATCC 11778 11 Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595 2 Bacillus pumilus ATCC 14884 12 Bifidobacterium breve ATCC 15700 3 Bacillus stearothermo philis ATCC 795 13 Bifidobacterium bifidum ATCC 11863 4 Bacillus subtilis ATCC 6333 14 Streptococcus faecalis ATCC 33186 5 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 15 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 6 Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 16 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 7 Bacilus coagulans
ATCC 7050 17 Escherichia coli ATCC 8739 8 Lactobacillus casei ATCC 334 18 Staphylococcus aureus ATCC653 8 9 Lactobacillus fermentum ATCC 9338 19 Streptococcus thermophilus ATCC 19258 10 Lactobacillus plantarum ATCC 8014 20 Bifidobacterium longum JCM 1217
25
2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Là một số chế phẩm probiotics trên thị trường - Gói bột SamubioTHYMO (kí hiệu mẫu A)
Công ty sản xuất: Công ty cổ phần Dược, vật tư y tế Hải Dương Số đăng kí: 12735/2011/YT-CNTC
Số lô: 010112. Hạn dùng: 300115 Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa
+ Lactobacillus acidophilus ≥108CFU + Bifidobacterium longum ≥108
CFU + Streptococcus faecalis ≥108CFU - Gói bột safikid BIO (kí hiệu mẫu B)
Công ty sản xuất: Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng- Học viện Quân Y.
Số đăng kí: 1757/2010/YT-CNTC Số lô: 1113. Hạn dùng: 11/2015 Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa
+ Lactobacillus acidophilus ≥108
CFU + Bifidobacterium longum ≥108CFU + Streptococcus thermophilus ≥108CFU - Gói bột L-Bio-3D (ký hiệu mẫu C)
Công ty sản xuất: Công ty liên doanh dược phẩm MEBIPHAR- AUSTRAPHARM
Số đăng kí: QLSP -0746-13
Số lô: 061213. Hạn dùng: 25/12/2015
Công thức: Mỗi gói 1g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic ≥108
CFU
+ Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum + Lactobacillus rhamnosus
26 Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc Số đăng kí: 3056/2013/ATTP - XNCB Số lô: 4002. Hạn dùng: 08.04.2017
Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic ≥108CFU + Lactobacillus acidophilus + Lactobacillus rhamnosus + Lactobacillus plantarum + Bifidobacterium longum + Streptococcus faecalis
- Gói bột Probiotics Lactomin plus (ký hiệu mẫu E) Công ty sản xuất: Novarex, Hàn Quốc
Số đăng kí: 1160/2014/XNQC - ATTP Số lô: 4002. Hạn dùng: 04.02.2017
Công thức: Mỗi gói 3g bột chứa hỗn hợp các vi khuẩn sinh acid lactic ≥108
CFU
+ Lactobacillus acidophilus + Bifidobacterium longum + Streptococcus faecalis
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng B. longum trong chế phẩm
Sử dụng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan, chúng tôi lựa chọn môi trường BSM agar để định lượng B. longum trong hỗn hợp [19], [25].
Chuẩn bị hỗn dịch thử: Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế phẩm. Cân chính xác khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thể tích tính theo mililit bằng 9 lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài viên bi thuỷ tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân tán đều trong dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1. Lấy 1000 l hỗn dịch trên cho
27
vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex được hỗn dịch có độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để thu được hỗn dịch có có độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7.
Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác 1000 l hỗn dịch có độ pha loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha loãng 10-6 và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM đặc (đã được tiệt trùng và để nguội xuống khoảng 45oC), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và ủ ở 37 1oC trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250).
Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công thức:
A = nTB d MTB
Trong đó:
A : số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói), nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU),
MTB : khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói), d : hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.
2.3.2. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A
2.3.2.1. Nguyên tắc chung
Kit API 20A là một hệ thống đã được tiêu chuẩn hóa của hãng BioMérieux (Pháp). Kit API 20A được dùng cùng với môi trường API 20A để định danh vi sinh vật kị khí, trong đó có chi Bifidobacterium.
Kit API 20A gồm 20 giếng chứa các chất nền khác nhau. Vi sinh vật cần xác định sẽ được cấy vào môi trường API 20A và nhỏ môi trường đã có vi sinh vật vào từng giếng, lúc này các chất nền trong giếng sẽ được hoà tan vào trong môi trường. Trong quá trình nuôi cấy sản phẩm chuyển hóa nếu có sẽ tự làm thay đổi màu môi trường hoặc thay đổi màu sau khi thêm thuốc thử. Tên của các chất nền sẽ được đề cập đến trong mục 2.3.2.2 13 .
28
2.3.2.2. Tiến hành
Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượng 2.3.1, lựa chọn một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang 5,0ml môi trường MRS lỏng, có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớp bề mặt và ủ trong điều kiện kị khí ở 37
1oC trong 24 giờ.
a. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.
Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì kết luận vi sinh vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.
b. Định danh vi sinh vật bằng kit API 20A:
Sau khi xác định vi sinh vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử thì tiếp tục cấy một quai cấy canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trường thạch máu, ủ trong điều kiện kị khí ở 37 1oC trong 18-24 giờ. Gặt vi sinh vật trên bề mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nước cất vô trùng thu được hỗn dịch gốc.
Nhỏ từ từ từng giọt hỗn dịch gốc ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml nước cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn
McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên.
Cho vào 4ml môi trường API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho vào ống nghiệm trên và lắc đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trường API 20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3 (so sánh độ đục bằng mắt thường).
Nhỏ môi trường API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ nhỏ phần tube. Riêng đối với giếng IND nhỏ dung dịch dầu khoáng vô trùng lên trên bề mặt giếng để tạo điều kiện kị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối với giếng GEL nhỏ cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2oC trong điều kiện kị khí trong vòng 24± 2h.
29
- Đối với giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớp dầu khoáng phía trên, trộn đều và để 2-3 phút. Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc kết quả trong vòng 5 phút. Kết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ.
- Đối với các giếng có chứa các đường khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một giọt thuốc thử BCP. Kết quả được ghi là dương tính nếu xuất hiện màu vàng hoặc vàng-xanh.
- Phản ứng CAT: Để kit tiếp xúc với không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm 2 giọt thuốc thử H2O2 3% vào một giếng dương tính bất kỳ. Kết quả được ghi là dương tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.
30
Bảng 2.4. Cách đọc kết quả kit Api 20A
Giếng Chất nền Hàm lượng(mg/gi ếng) Phản ứng Kết quả âm tính Dương tính
IND L-tryptophan 0,98 Sự hình thành indol
XYL-trộn đều /2-3 phút + HER/5 phút Vàng Đỏ URE Urea 0,648 Urease Vàng-cam Đỏ
GLU MAN LAC SAC MAL SAL XYL ARA D-glucose D-manitol D-lactose D-saccharose D-maltose Salicin D-xylose L-arabinose 1,96 1,96 1,96 1,86 1,96 1,64 1,64 1,64 Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa BCP Tím Vàng/ vàng-xanh GEL gelatin 0,6
Sự thủy phân gelatin
Không có sự khuếch tán chất màu Có sự khuếch tán chất màu đen ESC Esculin Sắt (III) citrat 0,36
0,11 Sự thủy phân Esculin
Vàng Nâu-đen Soi dưới đèn UV 365nm
Phát quang Không phát quang
GLY CEL MNE MLZ RAF SOR RHA TRE Glycerol D-cellobiose D-mannose D-melezitose D-raffinose D-sorbitol L-rhamnose D-trehalose 1,82 1,86 1,96 1,96 2,18 2,18 1,96 1,96 Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa BCP Tím Vàng/ Vàng-xanh
Sau khi tiếp xúc với không khí 30 phút, thêm H2O2 vào 1 giếng dương tính
CAT - Catalase Không có bọt khí Xuất hiện bọt khí
SPOR - Bào tử Không có Có
GRAM - Hồng Tím
31
Ghi kết quả vào phiếu theo dõi. Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.
2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự
2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự thuật PCR và giải trình tự
Sau khi lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng tách biệt, tiến hành tăng sinh trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 0,5ml dầu khoáng và được định danh đến chi
Bifidobacterium bằng kit API 20A như mô tả trong mục 2.3.2, tiếp tục cấy tăng sinh VSV từ phần sinh khối còn lại sang môi trường MRS lỏng, bổ sung thêm 0,5ml dầu khoáng vô khuẩn, ủ ở 37±10C trong điều kiện kỵ khí trong 24 giờ. Sau đó VSV trong ống môi trường MRS lỏng này sẽ được tách chiết DNA và định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự theo sơ đồ sau
Hình 2.1. Sơ đồ định tính B. longum bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự
VSV trong môi trường MRS lỏng Tách chiết DNA Kiểm tra sản phẩm tách Tiến hành phản ứng PCR với mồi đặc hiệu
Nhân dòng và giải trình tự
32
2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit
Nguyên tắc:
Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được phá vỡ nhờ lysozyme và dung dịch ly giải tế bào giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi sinh vật. Protein và RNA được tách khỏi hỗn hợp nhờ enzym RNAse và dung môi kết tủa protein. Cuối cùng DNA được tủa bằng Isopropanol.
DNA của các chủng nghiên cứu và của các vi sinh vật phân lập trong các mẫu được tách và tinh sạch bằng kit của Promega có cải tiến. Quy trình thực hiện như sau:
- Các chủng chuẩn được tăng sinh từ các ống gốc bằng môi trường MRS lỏng, ủ ở 370
C trong 48 giờ. Đối với các mẫu nghiên cứu, tiếp tục tăng sinh VSV trong môi trường MRS lỏng từ phần sinh khối của VSV được phân lập sau khi đã định danh đến chi Bifidobacterium (mục 2.3.2 )
- Lấy 1,0 – 1,5ml môi trường tăng sinh chủng trên vào ống nhựa 1,5ml. - Mang ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút loại dịch nổi thu lấy cắn. - Thêm 480µl dung dịch EDTA 50mM vào ống cắn, lắc đều.
- Thêm tiếp 120µl dung dịch lysozyme (nồng độ 20mg/ml) trộn đều.
- Ủ ở 370C trong 30-60 phút, sau đó ly tâm ở 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn.
- Thêm 600µl dung dịch Nuclei Lysis vào ống cắn vừa thu được. Dùng pipet đảo nhẹ tạo thành hỗn dịch.
- Ủ hỗn dịch trên ở 800
C trong 5 phút để ly giải tế bào, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng
- Thêm 3µl dung dịch RNAse vào dịch ly giải tế bào, trộn đều bằng cách đảo ống từ 5-7 phút.
- Ủ ở 370C trong 15-60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.