Promega
Tiến hành tăng sinh chủng B. longum chuẩn và các vi sinh vật trong các mẫu probiotics trong phần đối tượng nghiên cứu phân lập được ở mục 3.1, tiến hành tách DNA theo hướng dẫn tại mục 2.3.3.2. Tiến hành đo quang các dung dịch DNA mới tách theo mô tả trong mục 2.3.3.3 và pha loãng các dung dịch DNA bằng nước cất siêu tinh khiết vô khuẩn để thu được dung dịch DNA có nồng độ 50 ng/µl.
Bảng 3.4. Kết quả đo quang các dung dịch DNA mới tách
Đối tƣợng Atn Nồng độ dung dịch DNA (ng/µl) B. longum 0,1125 562,5 Mẫu A 0,0911 455,5 Mẫu B 0,0956 478 Mẫu C 0,1174 587 Mẫu D 0,0851 425,5 Mẫu E 0,1052 526
3.3.1.2. Kiểm tra khả năng tách DNA
Sau khi tách DNA, các dung dịch DNA được pha loãng tới nồng độ thích hợp. Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách bằng bằng phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn, với thành phần và chu trình như trong mục 2.3.3.5. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên bản gel agarose 1%. Kết quả được trình bày ở Hình 3.7
52
Từ Hình 3.7 cho thấy, phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA đặc hiệu đều cho các băng nhân bản kích thước 1500 bp, trong khi ở mẫu chứng âm (không có DNA) không xuất hiện băng nhân bản nào. Kết quả này cho thấy đã thu được các khuôn DNA của các đối tượng nghiên cứu. DNA sau khi tách chiết được bảo quản ở -200C để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tƣợng vi sinh vật thuộc đối tƣợng nghiên cứu
Sử dụng cặp mồi BlonF /BlonR để nhân bản các đoạn gen của các đối tượng nghiên cứu đã tách được ở trên (mục 3.3.1.1).
Thành phần của phản ứng PCR được ghi lại tại Bảng 3.5 M 1 2 3 4 5 6 7
1500bp bp
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA bằng cặp mồi ID16R08F & IDL16R09R
M: Marker 100 bp (Invitrogen)
Giếng 1: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch B. longum JCM 1217 Giếng 2: Chứng âm ( Khuôn là nước cất)
Giếng 3-7: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch tăng sinh từ khuẩn lạc phân lập từ các mẫu A, B, C, D và E.
53 Bảng 3.5. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích ( l) 1 Đệm PCR(10X) 2,5 2 dNTPs (2mM) 2,5 3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75 4 Mồi xuôi (10 pmol) 1 5 Mồi ngược (10 pmol) 1
6
Taq DNA polymerase (5u/ l)
0,1
7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25
Với thành phần như trên tiến hành phản ứng PCR với chu trình nhiệt: 94oC – 45 giây
94oC – 5 phút 56oC –45 giây x 30 chu kỳ 72oC - 5 phút 4oC – ∞ 72oC – 30 giây
Kết quả phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% và được ghi lại kết quả bằng máy chụp ảnh bản gel UVDI-312 (Hình 3.8)
54
Kết quả thu được ở Hình 3.8 cho thấy với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng như trên, với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BlonF/BlonR, chúng tôi đã thu được băng nhân bản có kích thước khoảng hơn 800 bp ở giếng với khuôn là DNA tách chiết từ chủng chuẩn B. longumJCM1217 (giếng 1). Kích thước băng này hoàn toàn phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của B. longum là 831 bp. Trong khi đó, chúng tôi không thu được băng nhân bản nào ở mẫu không chứa DNA (chứng âm-giếng 2).
Như vậy, kết quả thí nghiệm thu được cho phép khẳng định với cặp mồi BlonF/BlonR chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen đặc hiệu tương ứng của B. longum.
Với các giếng từ 3-7 có khuôn là DNA tách từ các vi sinh vật phân lập được từ các mẫu đã nêu trong phần đối tượng nghiên cứu, cũng đều cho băng nhân bản có kích thước khoảng 831 bp, tương ứng với với băng nhân bản với khuôn là DNA của
B. longumJCM 1217. Điều này bước đầu đã khẳng định các vi sinh vật phân lập từ các mẫu này là B. longum. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR
M: Marker 100 bp ( Invitrogen)
Giếng 1: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch B. longumJCM 1217
Giếng 2: Chứng âm ( Khuôn là nước cất không chứa DNA)
Giếng 3-7: Khuôn là DNA tách chiết từ hỗn dịch tăng sinh từ khuẩn lạc phân lập được từ các mẫu A, B, C, D và E.
800 bp
55
3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự
3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi sinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas
Sử dụng 5 mẫu DNA là sản phẩm nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR để làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân dòng gen.
Sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu được điện di trên gel agarose 1%, kết quả chúng tôi đã thu được băng DNA có kích thước 831 bp. Các băng DNA này được cắt chính xác khỏi bản gel agarose và tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình của nhà sản xuất nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dư thừa của phản ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch tiếp tục được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả chúng tôi thu được trên Hình 3.9 cho thấy chúng tôi đã thu được sản phẩm DNA hoàn toàn tinh sạch, có kích thước 831 bp.
Hình 3.9.Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel agarose 1%.
M: Marker 100 bp ( Promega )
Giếng 1-5: Sản phẩm PCR tinh sạch của các mẫu nghiên cứu
Các sản phẩm PCR tinh sạch nhân bản 5 đoạn gen đặc hiệu được bảo quản ở - 20oC để sử dụng cho thí nghiệm nhân dòng tiếp theo.
831 bp
56
3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α tế bào E. coli chủng DH5α
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã dòng hóa 5 đoạn gen đặc hiệu trên vào vector nhân dòng pGEMT-easy. Vector nhân dòng này được thiết kế có chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli, đồng thời chứa gen chỉ thị kháng kháng sinh Ampicillin,cho phép chọn lọc các thể biến nạp mang vector này trên môi trường nuôi cấy có Ampicillin. Ngoài ra, vector nhân dòng còn chứa gen chọn lọc giúp phân biệt các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp và plasmid tự đóng vòng.
Hình 3.10. Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT- Easy
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector nhân dòng được thực hiện theo quy trình kèm theo của nhà sản xuất. Hỗn hợp phản ứng gắn đầu bằng sau đó được chúng tôi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả biến nạp sản phẩm PCR vào tế bào E. coli trên Hình 3.11 cho thấy chúng tôi đã thu được nhiều khuẩn lạc trắng (có khả năng mang vector tái tổ hợp) trên môi trường chọn lọc có bổ sung ampiciline 100 µg/ml, phủ trên bề mặt cơ chất X-gal (20 l, nồng độ 20 mg/ml) và IPTG (20 l, nồng độ 100mM )
57
Hình 3.11. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli DH 5α và cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, phủ trên bề mặt cơ chất X-gal (20 l, nồng độ 20 mg/ml) và IPTG (20 l, nồng độ 100mM )
3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổ hợp
Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong vector nhân dòng, đối với mỗi mẫu, chúng tôi chọn 1 khuẩn lạc dương tính (có màu trắng) để tinh sạch plasmid và kiểm tra plasmid này bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn.
a/ Kiểm tra sự có mặt các phân đoạn
Khuẩn lạc dương tính được nuôi cấy và tách chiết plasmid theo quy trình tách chiết plasmid như mô tả ở mục 2.3.3.7c. Sản phẩm DNA tinh sạch được chúng tôi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi khác nhau: cặp mồi đặc hiệu Blon F/Blon R và cặp mồi đặc hiệu của vector. Trong đó, cặp mồi vector là hai trình tự nằm trên vector nhân dòng, có khoảng cách khoảng 186 bp.
58
Hình 3.12.Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen có kích thước 831 bp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M: Marker 100 bp (Invitrogen)
Giếng 1-7 : sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu BlonF/BlonR. Giếng 8-14: sản phẩm PCR với cặp mồi vector
Giếng 1: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của B. longum JCM 1217
Giếng 2,9: đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn.
Giếng 3-7; 10-14: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của các plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen có kích thước 831bp.
Giếng 8: sản phẩm PCR với khuôn là vector nhân dòng nguyên bản tách từ khuẩn lạc xanh
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% ở Hình 3.12 cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu có kích thước khoảng 831 bp ( giếng 1, 3-7), tương ứng với kích thước tính toán lí thuyết của đoạn gen đặc hiệu của các loài B. longum. Sản phẩm PCR với cặp mồi vector và khuôn là plasmid tách từ khuẩn lạc xanh cho một băng điện di với kích thước khoảng 186 bp, tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết (giếng 8). Sản phẩm PCR với cặp mồi vector khi điện di trên gel agarose 1% cho một băng có kích thước khoảng 1017bp ( giếng 10-14), kích thước này phù hợp với kích thước đoạn DNA theo tính toán lý thuyết cộng với 186 bp của plasmid. Đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi
1017bp 831 bp
59
không thu được băng DNA nào (giếng 2, 9). Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định plasmid tinh sạch được là plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen phân lập được từ genome của loài B. longum
với enzyme cắt giới hạn
Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã được chèn vào vector nhân dòng là đoạn gen có kích thước 831bp, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp đã được tinh sạch từ khuẩn lạc dương tính. Theo lý thuyết, trên vector pGEMT Easy (Hình 3.10) có hai vị trí cắt giới hạn của EcoRI nằm trong vùng đa điểm cắt. Như vậy, khi được xử lí bằng EcoRI vector tái tổ hợp sẽ bị cắt thành 2 đoạn DNA, một đoạn chính là các đoạn gen được chèn vào và một đoạn là bộ khung vector có kích thước 3 kb.
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang các phân đoạn 831 bp bằng enzyme EcoRI.
M1:Marker 1000 bp (Fermentas) M2: Marker 100 bp (Promega)
Giếng 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12: vector tái tổ hợp nguyên bản; Giếng 2, 4, 6,8,10: sản phẩm cắt giới hạn. M1 M2 1 2 M2 3 4 M2 5 6 M2 M2 7 8 M2 9 10 M2 11 12 M1 KL xanh 831 831 831 831 831 3000 3000
60
Kết quả thu được trên Hình 3.13 cho thấy các sản phẩm cắt vector tái tố hợp mang các đoạn gen đích của các đối tượng nghiên cứu xuất hiện 2 băng DNA (giếng 2, 4, 6, 8, 10): trong đó băng DNA 3 kb là bộ khung nguyên bản của vector, và các đoạn DNA kích thước 831bp là kích thước tương ứng của đoạn gen đặc hiệu nhân bản từ hệ gen B. longum theo tính toán lí thuyết. Kết quả thu được ở trên cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dòng thành công các đoạn gen phân lập được từ genome của các loài phân lập từ đối tượng nghiên cứu của đề tài.
Các vector nhân dòng mang các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu được tinh sạch và bảo quản ở -20oC. Các dòng tế bào E. coli mang các vector tái hợp chứa các đoạn gen này được giữ trong glycerol 25% và bảo quản ở -80o
C.
3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp
Để khẳng định DNA tách chiết được từ các mẫu trong phần đối tượng nghiên cứu có đúng là của loài B. longum hay không, chúng tôi đã tiến hành nhân bản đoạn gen 831 bp bằng quy trình đã thiết lập, nhân dòng đoạn gen này vào vector nhân dòng. Sản phẩm vector nhân dòng mang đoạn gen đặc hiệu 831 bp được gửi đi giải trình tự.
Kết quả giải trình tự của mẫu C như sau:
GAAGGAATCCAACGCGTTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCA GGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTTTCCAGTTGATCGCATGGTCT TCTGGGAAAGCTTTCGCGGTATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGC TTGACGGCGGGGTAACGGCCCACCGTGGCTTCGACGGGTAGCCGG CCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAA GCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGT AAACCTCTTTTATCGGGGAGCAAGCGAGAGTGAGTTTACCCGTTGA ATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGC GGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCC GCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAAT TCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAA
61 TGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAA AGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TATACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGT CGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAA GGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAGCGGGCGGA GCATGCGGAATTATTCGATGCAACGCGAAGAACCCTTACCCTGGGG CTTGACATGTTTCCCGGACGGTTGGTTAGAAGAATAACGGGC
Kết quả giải trình tự trên được chúng tôi tiến hành so sánh trình tự với các trình tự khác trên ngân hàng gen thế giới bằng ứng dụng BLAST (Basic Local Alignmen CSearch Tool) trên trang web của NCBI (National Center for
Biotechnology Information-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [37].
Kết quả blast khẳng định đoạn gen nhân bản được chính là đoạn gen được phân lập từ hệ gen của Bifidobacterium longum.
62
Kết quả giải trình tự đều cho thấy cả 5 mẫu nghiên cứu đều chứa B. longum. Kết quả giải trình tự của các mẫu A, B, D và E được trình bày ở Phụ lục 7, Phụ lục 8, Phụ lục 9 và Phụ lục 10.
3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trƣờng định lƣợng BSM agar
Tiến hành kiểm tra tính chọn lọc được mô tả trong mục 2.3.4.1a. Kết quả thử nghiệm được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar
STT Tên chủng
Môi trƣờng BSM agar (số lƣợng khuẩn lạc trên đĩa)
Môi trƣờng MRS agar (số lƣợng khuẩn lạc trên đĩa) 10-5 10-6 10-7 10-5 10-6 10-7 1 Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595 Không mọc Không mọc Không mọc Nhiều 45 +37 4 +3 2 Lactobacillus ATCC 4356 Không mọc Không mọc Không mọc Nhiều 40+ 50 2+4 3 Lactobacillus plantarum ATCC 8014 Không mọc Không mọc Không mọc Nhiều 35+29 2+2 4 Lactobacillus casei ATCC 334 Không mọc Không mọc Không mọc Nhiều 48 +39 3+5 5 Lactobacillus fermentum ATCC 9338 Không mọc Không mọc Không mọc Nhiều 37+ 46 3+3 6 Streptococcus faecalis ATCC 33186 Không mọc Không mọc Không mọc Nhiều 50 +57 5+4 7 Bifidobacterium longum JCM 1217 Nhiều 45 +34 3 +4 Nhiều 48+ 38 4+4
63
Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy các chủng thuộc chi Lactobacillus và
Streptococcus faecalis không phát triển được trên môi trường BSM agar, trong khi đó vẫn mọc tốt trên môi trường MRS agar. B. longum mọc tốt trên cả hai môi trường MRS agar và BSM agar. Như vậy chứng tỏ môi trường BSM agar có tính chọn lọc cao, thích hợp để định lượng và phân lập riêng B. longum trong hỗn hợp vi sinh vật đã được nêu trong phần đối tượng nghiên cứu. Trên môi trường MRS agar khuẩn lạc của B. longum có màu trắng, còn trên môi trường BSM agar khuẩn lạc của B. longum có màu tím đỏ rất thuận tiện cho việc nhận biết và đếm khuẩn lạc
Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trường BSM agar
3.4.2. Độ lặp lại của phép định lƣợng
Tiến hành phép thử định lượng như đã mô tả ở mục 2.3.1. Tiến hành định lượng lặp lại 10 lần. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7
64
Bảng 3. 7. Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong mẫu A
Áp dụng công thức tính đã trình bày ở mục 2.3.4.1 ta được Sr = 0,04. Vậy Sr < 0,25.
Như vậy phương pháp định lượng B. longum trong đề tài này có độ lặp lại chấp nhận được đối với phương pháp đếm vi sinh vật.
3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API 20A API 20A
Tiến hành định tính chủng vi sinh vật chuẩn B. longum bằng API kit theo phương pháp ghi trong mục 2.3.2. Kết quả định danh được trình bày ở Hình 3.15 và
Phụ lục 6 .
Lần Nồng độ 10-6
TB CFU/gói
Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 3
Lần 1 30 36 27 31 96x106 Lần 2 29 40 42 37 114x106 Lần 3 34 38 47 40 124x106 Lần 4 30 35 42 36 111x106 Lần 5 41 31 31 34 105x106 Lần 6 48 33 36 39 120x106 Lần 7 40 30 36 35 108x106 Lần 8 29 39 31 33 102x106 Lần 9 31 35 43 36 111x106 Lần 10 37 30 28 32 99x106
65
Hình 3.15. Định danh B. longum JCM 1217 bằng kit Api 20A
Kết quả định danh cho thấy vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium với % ID là
97,1%
Như vậy phương pháp định tính vi sinh vật đến chi Bifidobacterium bằng kit Api 20A có độ đặc hiệu cao.