Nguyên tắc:
Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được phá vỡ nhờ lysozyme và dung dịch ly giải tế bào giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi sinh vật. Protein và RNA được tách khỏi hỗn hợp nhờ enzym RNAse và dung môi kết tủa protein. Cuối cùng DNA được tủa bằng Isopropanol.
DNA của các chủng nghiên cứu và của các vi sinh vật phân lập trong các mẫu được tách và tinh sạch bằng kit của Promega có cải tiến. Quy trình thực hiện như sau:
- Các chủng chuẩn được tăng sinh từ các ống gốc bằng môi trường MRS lỏng, ủ ở 370
C trong 48 giờ. Đối với các mẫu nghiên cứu, tiếp tục tăng sinh VSV trong môi trường MRS lỏng từ phần sinh khối của VSV được phân lập sau khi đã định danh đến chi Bifidobacterium (mục 2.3.2 )
- Lấy 1,0 – 1,5ml môi trường tăng sinh chủng trên vào ống nhựa 1,5ml. - Mang ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút loại dịch nổi thu lấy cắn. - Thêm 480µl dung dịch EDTA 50mM vào ống cắn, lắc đều.
- Thêm tiếp 120µl dung dịch lysozyme (nồng độ 20mg/ml) trộn đều.
- Ủ ở 370C trong 30-60 phút, sau đó ly tâm ở 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn.
- Thêm 600µl dung dịch Nuclei Lysis vào ống cắn vừa thu được. Dùng pipet đảo nhẹ tạo thành hỗn dịch.
- Ủ hỗn dịch trên ở 800
C trong 5 phút để ly giải tế bào, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng
- Thêm 3µl dung dịch RNAse vào dịch ly giải tế bào, trộn đều bằng cách đảo ống từ 5-7 phút.
- Ủ ở 370C trong 15-60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Thêm 200µl dung dịch Protein Precipitation (dung dịch kết tủa protein) vào hỗn hợp trên, lắc mạnh trong 20 giây.
- Ủ trong đá lạnh 5 phút.
33
- Chuyển dịch nổi chứa DNA vào một ống nhựa 1,5ml sạch khác chứa 600µl
isopropanol. Trộn đều bằng cách đảo ngược ống từ 5-7 lần. - Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cắn. Thêm 600µl dung dịch ethanol 70% vào ống, đảo nhẹ nhàng để rửa cắn DNA.
- Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Cẩn thận loại hết ethanol thừa, để khô tự nhiên trong 10-15 phút.
- Thêm 100µl dung dịch DNA Rehydration (dung dịch hòa tan DNA) vào ống chứa cắn DNA, ủ 650C trong 1 giờ.
- Bảo quản dung dịch DNA vừa tách được ở -200
C.
2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260)