16S ribosome RNA là một thành phần của các tiểu đơn vị 30s nhỏ trong ribosome vi khuẩn. Các gen mã hóa cho thành phần này được gọi là 16S rDNA có tính đặc thù cho vi khuẩn. Dựa trên tính chất này tiến hành phản ứng nhân bản đoan gen 16s rDNA bằng mồi đặc hiệu để chứng minh sự có mặt của DNA vi khuẩn. * Phản ứng PCR
Kiểm tra sản phẩm DNA tách được bằng phản ứng nhân bản đoạn gen đặc hiệu 16S rDNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.
35
Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Đệm PCR (10X) 2,5 2 dNTPs (2mM) 2,5 3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75 4 ID16R08F (10 pmol) 1 5 IDL16R09R (10 pmol) 1 6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1 7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA: 940
C trong 5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 940
C trong 45 giây để làm biến tính DNA, 560C trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong 1 phút 30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 720C trong 5 phút và giữ ở 40C cho đến khi phân tích.
* Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị bản gel có nồng độ 1% (kl/tt) trong đệm TBE (pH 8,0) (Tris-Boric acid-EDTA), nhuộm sản phẩm theo kỹ thuật điện di trên gel giới thiệu ở mục
1.3.5.2 b, kèm theo một giếng nhỏ chứa thang kích thước DNA chuẩn. Điện di bằng máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 ở 100V trong 30 phút. Nhuộm sản phẩm bằng dung dịch ethidium bromide 0,1% trong 15-30 phút. Ghi lại kết quả bằng máy chụp ảnh bản gel UVDI- 312.