a. Kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar
Tăng sinh các chủng chuẩn được ghi trong Bảng 2.9 trong môi trường MRS lỏng, có thêm lớp dầu khoáng ở bề mặt, ủ ở 35-37oC trong 48 giờ trong điều kiện kỵ khí. Sau đó mang hỗn dịch li tâm với tốc độ 3000-4000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi, thu lấy sinh khối. Thêm từ từ vào ống nghiệm một lượng dung dịch nước muối sinh
40
lý 0,9 % vô khuẩn, trộn đều cho đến khi thu được hỗn dịch có độ đục tương đương với độ đục Mc Farland số 2 (khoảng 6,0 x108
CFU/ml).
Chuẩn bị một dãy ống nghiệm thủy tinh vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn. Lấy 1ml hỗn dịch chủng ở trên thêm vào một ống nghiệm trên, lắc đều thu được hỗn địch có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng 10-7.
- Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, với mỗi độ pha loãng tiến hành cấy vi khuẩn trên 4 đĩa. Cấy vào mỗi đĩa petri vô trùng 1ml hỗn dịch chủng ở độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, thêm vào 2 đĩa ở cùng một độ pha loãng 15- 20ml môi trường BSM agar vô trùng đã làm nguội đến 45-500
C. Thêm vào 2 đĩa ở cùng một độ pha loãng còn lại 15-20ml môi trường MRS agar. Ủ ở 35-37oC trong điều kiện kỵ khí. Sau 48 giờ đem ra đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa (chỉ đếm đĩa có 25-250 khuẩn lạc) và so sánh số lượng khuẩn lạc thu được trên 2 môi trường.
Bảng 2.9. Các chủng chuẩn được dùng để kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar
STT Tên chủng Kí hiệu
1 Lactobacillus rhamnosus ATCC9595
2 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356
3 Lactobacillus plantarum ATCC 8014
4 Lactobacillus casei ATCC 334
5 Lactobacillus fermentum ATCC 9338
6 Streptococcus faecalis ATCC 33186
7 Bifidobacterium longum JCM 1217
41
b. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp [7], [17], [18].
Tiến hành phép thử định lượng như đã mô tả ở mục 2.3.1. Tiến hành định lượng lặp lại 10 lần.
Đánh giá kết quả
Tất cả các kết quả định lượng được chuyển sang dạng log10 (để thu được mẫu có phân bố tương đối chuẩn) trước khi phân tích thống kê.
Yêu cầu: Sr ≤ 0,25
Tính độ lệch chuẩn Sr theo công thức:
Trong đó:
- xi: Kết quả của mỗi lần lặp lại
- x: Kết quả trung bình của các lần lặp lại - n: Số lần lặp lại (n=10)