thuật PCR
Tiến hành quy trình đánh giá độ đặc hiệu như trong mục 2.3.4.3 a. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi trên 20 loài chủng vi sinh vật chuẩn được trình bày ở Bảng 3.8 và Hình 3.16
66
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi Blon F/Blon R trên 20 chủng
TT Tên chủng Kết quả
PCR
TT Tên chủng Kết
quả PCR 1 Bacillus cereus ATCC
11778
- 11 Lactobacillus fermentum
ATCC 9338
-
2 Bacillus pumilus ATCC 14884 - 12 Lactobacillus plantarum ATCC 8014 - 3 Bacillus stearothermophilis ATCC 795 - 13 Bifidobacterium breve ATCC 15700 -
4 Bacillus subtilis ATCC 6633 - 14 Bifidobacterium bifidum ATCC11863 - 5 Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595 - 15 Streptococcus faecalis ATCC 33186 - 6 Lactobacillus casei ATCC 334 - 16 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 - 7 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 - 17 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 - 8 Bacillus coagulans ATCC 7050 - 18 Escherichia coli ATCC8739 - 9 Bifidobacterium longum JCM 1217 + 19 Staphylococcus aureus ATCC6538 - 10 Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 - 20 Salmonella typhimurium ATCC 14028 -
67
Ghi chú: (-): Kết quả PCR âm tính: không xuất hiện băng nhân bản. (+): Kết quả PCR dương tính: xuất hiện băng nhân bản
Kết quả trên cho thấy, với cặp mồi Blon F/ Blon R quy trình PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu chỉ cho kết quả PCR dương tính với khuôn là DNA của loài
B. longum trong khi 19 loài vi sinh vật dùng để kiểm tra độ đặc hiệu còn lại đều có kết quả PCR âm tính.
*Tính độ đặc hiệu:
Áp dụng vào công thức
Phép thử Chủng chuẩn Cộng
Dương tính Âm tính
Kỹ thuật PCR Dương tính a (1) b (0) a+b Âm tính c (0) d (19) c+d
Cộng a+c b+d a+b+c+d
* Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật +số trường hợp dương tính giả) = d/(d+b)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M 14 15 16 17 18 19 20
831bp
Hình 3.16.Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B.longum
M: Marker 100 bp
Giếng 1,14: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của B. longum JCM 1217 Giếng 2-13,15-20: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của 19 loài vi khuẩn khác được trình bày ở Bảng 3.8
68
Trong đó: d: số trường hợp âm tính thật = 19 (19 mẫu không phải là loài B. longum đều có kết quả PCR âm tính).
b: số trường hợp dương tính giả = 0 ( các chủng vi sinh vật đều là chủng chuẩn, đã được chứng nhận có nguồn gốc rõ ràng. Không có chủng vi sinh vật khác ngoài B. longum JCM 1217 có kết quả PCR dương tính)
Như vậy, độ đặc hiệu của cặp mồi BlonF/BlonR cũng như quy trình đã thiết lập để nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho loài B. longum là: 19/(19+0)= 1 (100%)
Kết luận: Với các thành phần phản ứng, quy trình đã thiết lập và cặp mồi đã
thiết kế, chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen đặc hiệu cho đối tượng nghiên cứu. Trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu, quy trình đạt độ đặc hiệu rất cao (100%).
3.4.5. Xác định ngƣỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu.
Tiến hành quy trình xác định ngưỡng phát hiện như mô tả ở mục 2.3.4.3b. Kết quả đếm số lượng hỗn dịch B. longum chuẩn được ghi tại bảng như sau.
Bảng 3.9. Kết quả đếm số lượng vi khuẩn B. longum
Độ pha loãng 10-6 10-7 10-8
Đĩa 1(CFU/đĩa) Nhiều 115 9 Đĩa 2 (CFU/đĩa) Nhiều 127 7
Trung bình 121
Dd D (CFU/ml) 1,21 x 109
Từ hỗn dịch D trên pha loãng thành một dãy các dung dịch có nồng độ 109CFU/ml, 108 CFU/ml, 107 CFU/ml, 106 CFU/ml, 105 CFU/ml và 104CFU/ml.
Tách chiết DNA từ các hỗn dịch này theo quy trình được trình bày ở mục 2.3.3.2. Tiến hành phản ứng PCR đơn mồi với khuôn là các DNA tách được từ hỗn dịch ở trên. Sau đó điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu được như sau
69
Bảng 3.10. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện
Nồng độ vi khuẩn Kết quả PCR trong các lần thử Trong hỗn dịch trước khi tách chiết (CFU/ml) Trong dịch chiết DNA (copy/µl)(*) 1 2 3 109 107 ++ ++ ++ 108 106 ++ ++ ++ 107 105 ++ ++ ++ 106 104 ++ ++ + 105 103 + + + 104 102 - - -
(*) Vì DNA sau khi tách chiết được hòa trở lại trong 100µl DNA Rehydration Solution, nên số lượng bản copy của phân tử DNA trong dung dịch sau khi tách chiết sẽ giảm 100 lần so với số lượng vi khuẩn bắt đầu trong hỗn dịch trước khi tách chiết.
70 Kết quả cho thấy:
- Ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu cho B. longum
là 105 CFU/ml vi khuẩn (tương ứng với khoảng 103copy/µl dùng làm khuôn cho phản ứng PCR). Kết quả được thể hiện như Hình 3.17
M 1 2 3 4 5 6
831 bp
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡng phát hiện của
quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B.longum
M: Marker 100 bp (Invitrogen)
Giếng 1-6: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tách chiết từ nồng độ chủng từ 109 CFU/ml vi khuẩn đến 104 CFU/ml vi khuẩn (tương ứng với khoảng 107 copy/µl đến 102 copy/µl dùng làm khuôn cho phản ứng PCR)
71
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
Hiện nay, các chế phẩm probiotics lưu hành trên thị trường hầu hết là các sản phẩm hỗn hợp của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên các tiêu chuẩn cơ sở do các nhà sản xuất đưa ra còn rất nhiều thiếu sót. Việc định lượng chỉ dừng lại ở việc đếm tổng số vi sinh vật trong mẫu. Trong đa số các trường hợp, định danh còn rất sơ sài, chỉ dừng lại ở phản ứng nhuộm soi và một vài phản ứng sinh hóa. Do đó, nếu thực hiện theo tiêu chuẩn, rất khó để kết luận mẫu đạt hay không và sẽ ảnh hưởng đến quyền lợi của bệnh nhân. Xuất phát từ thực tế, nhu cầu cấp thiết đặt ra là phải nghiên cứu định lượng, định danh đến loài đối với các vi sinh vật đã được ghi trên nhãn của chế phẩm. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc định danh vi sinh vật không chỉ bao gồm kiểu hình mà còn phải định danh kiểu gen.
Nghiên cứu trước đây của Nguyễn Thị Thu Hường [4] đã ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh một số vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus trong hỗn hợp nhiều vi sinh vật bằng cách tách chiết DNA trực tiếp từ mẫu. Trong nghiên cứu này, tác giả đã thành công trong việc định danh đến loài một số Lactobacillus trong hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật thuộc chi Lactobaccillus mà bằng các phản ứng sinh hoá không thể thực hiện được. Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là không phân biệt được vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết. Với quy trình đã xây dựng được trong đề tài này, chúng tôi đã định lượng riêng được B. longum trong hỗn hợp đồng thời phân lập được khuẩn lạc thuần khiết để tiến hành định danh kiểu hình bằng kit sinh hóa và định danh kiểu gen bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự. Do đó sẽ khẳng định được chắc chắn số lượng B. longum có mặt trong hỗn hợp ở nồng độ là bao nhiêu. Điều này rất có ý nghĩa trong việc kiểm tra giám sát chất lượng thuốc.
Ứng dụng quy trình đã thiết lập, chúng tôi đã kiểm tra được một số mẫu lưu hành trên thị trường, khẳng định được chắc chắn các sản phẩm này đều có chứa B. longum như trên nhãn do nhà sản xuất công bố. Với những mẫu probiotics mà nhà sản xuất chỉ công bố tổng số lượng vi sinh vật trong hỗn hợp (L-Bio-3D, Lackid,
72
Lactominplus ), việc sử dụng môi trường BSM agar để định lượng riêng B.longum
vẫn có ý nghĩa trong việc phân lập được khuẩn lạc thuần khiết để định danh B. longum .
Sử dụng kit Api 20A chỉ cho phép định danh đến chi Bifidobacterium, nhưng theo quy định gần đây về tiêu chuẩn chất lượng probiotics [16], [10], [32] việc định danh kiểu hình vẫn rất cần thiết. Đồng thời, nghiên cứu sử dụng kit Api 20A cũng cho phép định danh đến loài đối với Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis, và Bifidobacterium dentium bằng cách làm thêm các test bổ sung. Các vi khuẩn này cũng hay được dùng trong các chế phẩm probiotic. Hơn nữa do không yêu cầu kỹ thuật cao, chi phí rẻ nên việc sử dụng kit Api 20A để định danh một số probiotics thuộc chi Bifidobacterium rất dễ áp dụng ở các trung tâm kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm chức năng, nhằm góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng các chế phẩm probiotic ở địa phương.
Để định danh đến loài B. longum, công cụ hiệu quả nhất vẫn là kỹ thuật PCR và giải trình tự. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có độ nhạy và độ chính xác rất cao, vượt trội so với các phương pháp thông thường. Tuy nhiên, đây cũng không phải là một phương pháp hoàn hảo vì vẫn có một số hạn chế: yêu cầu kỹ thuật viên có trình độ cao, trang thiết bị hiện đại, đắt tiền, quy trình thực hiện phức tạp không dễ áp dụng ở mọi phòng kiểm nghiệm. Mặc dù vậy, với những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, tính đặc hiệu cũng như khả năng xác định chính xác đến loài, kỹ thuật PCR và giải trình tự ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong việc định danh B. longum cũng như nhiều vi khẩn khác trong các chế phẩm probiotics, đặc biệt là đối với những chế phẩm có chứa nhiều vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium.
73
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN:
Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã đạt được mục tiêu đề ra:
1. Đã xây dựng được quy trình định tính, định lượng B. longum trong hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật bằng việc sử dụng môi trường BSM agar, kit API 20A, kỹ thuật PCR và giải trình tự. Với qui trình này, chúng tôi sẽ khẳng định được chính xác đến loài B. longum với số lượng là bao nhiêu. Điều này rất có ý nghĩa trong công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc. Ứng dụng được quy trình nghiên cứu để định tính, định lượng B. longum trong một số chế phẩm lưu hành trên thị trường như: Samubiothymo, Safikid BIO, L- Bio-3D, Lackid và Lactomin plus.
2. Đã thẩm định được độ lặp lại của phương pháp định lượng, độ đặc hiệu của kỹ thuật định danh bằng kit sinh hóa, độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR đơn mồi và giải trình tự.
KIẾN NGHỊ:
Chúng tôi có một số kiến nghị sau:
1. Do gặp khó khăn trong việc mua được hỗn dịch B. longum chuẩn có số lượng biết trước, nên chúng tôi chưa thẩm định được độ đúng của phép định lượng. Do đó tiếp theo đây chúng tôi sẽ tiếp tục tra cứu và đặt mua hỗn dịch chuẩn này để thẩm định độ đúng.
2. Tiếp tục nghiên cứu quy trình định danh một số loài khác thuộc chi
Bifidobacterium cũng hay được sử dụng trong các chế phẩm probiotics như
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis...
bằng việc sử dụng kit API 20A cùng với kỹ thuật PCR và giải trình tự. 3. Tiếp tục nghiên cứu định tính, định lượng một số vi khuẩn probiotic đang
gặp nhiều khó khăn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng như
74
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Công ty liên doanh Dược phẩm Mebiphar-Austrapharm (2007), Tiêu chuẩn nhà sản xuất: Thuốc L-BIO-3D.
2. Công ty liên doanh Dược phẩm Mebiphar-Austrapharm (2007), Tiêu chuẩn nhà sản xuất: Thuốc Lactomin plus.
3. Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp (2008), "Vi sinh vật trong chế phẩm Probiotics", Tạp chí Dược học, số 390, Bộ Y tế, Hà nội.
4. Nguyễn Thị Thu Hường (2012), Định tính một số loài thuộc chi Lactobacillus trong chế phẩm probiotics lưu hành trên thị trường bằng kỹ thuật PCR, Hà Nội
5. Tổng cụ đo lường Việt Nam (2008), TCVN 7849 :2008 Sữa và sản phẩm .
sữa. Định lượng Lactobacillus acidophilus giả định trên môi trường chọn lọc, kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 37 0C.
6. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Giáo dục, tập 5, tr. 129-154.
7. Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (2013), Định trị và tính toán độ không đảm đo kết quả thử nghiệm vi sinh., Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Hùng Vân (2009), PCR và Realtime PCR. Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh.
TIẾNG ANH
9. Akatsu H, Iwabuchi N, Xiao JZ, Matsuyama Z, Kurihara R, Okuda K, Yamamoto T, Maruyama M (2012), “Clinical Effects of Probiotic
Bifidobacterium longum BB536 on Immune Function and Intestinal Microbiota in Elderly Patients Receiving Enteral Tube Feeding”, JPEN J Parenter Enteral Nutr, 37(5), p. 631-640.
75
10.Alschuler Lise (2011), “Ensuring Probiotics quality”, Natural medicine journal, 3(10).
11. Amenta M, Cascio MT, Di Fiore P, Venturini I (2006), “Diet and chronic constipation. Benefits of oral supplementation with symbiotic zir fos (Bifidobacteriumlongum W11 + FOS Actilight)”, Actabiomed, 77(3), p.157- 162.
12. Bahaka D, Neut C, Khattabi A, Monget D, Gavini F (1993), “Phenotypic and genomic analyses of human strains belonging or related to Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium breve”, Int J Syst Bacteriol, 43(3), p. 565-73.
13. BioMerieux, Inc (2011), API 20A, France.
14. Ethiopian standard ES ISO 29981 (2012), Milk products Enumeration of presumptive bifidobacteria Colonycount technique at 37 °C.
15. Hamaji Y, Fujimori M, Sasaki T, Matsuhashi H, Matsui-Seki K, Shimatani- Shibata Y, Kano Y, Amano J and Taniguchi S (2007), “Strong Enhancement of Recombinant Cytosine Deaminase Activity in Bifidobacterium longum for Tumor-Targeting Enzyme/Prodrug Therapy”, Biosci. Biotechnol. Biochem, 71, p. 874-883.
16. Indian council of medical research (2011), Guidelines for the Evalution of Probiotics in Food, Indian.
17.IOS/TS 19036 (2006), Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations.
18. IOS/TS 4833 (2003), Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of microorganisms – Colony – count technique at 30oC.
19. Janet E L Corry, Gordon D W Curtis, Baird.R.M (2012), Handbook of Culture Media for Food and Water Microbiology, 3rd Edition, Royal Society of Chemistry, p. 199-221.
76
20. Kwon HS, Yang EH, Yeon SW, Kang BH, Kim TY (2004), “Rapid identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA.”, FEMS Microbiology Letters, 239, p 267-275.
21. Lahtinen SJ, Gueimonde M, Ouwehand AC (2006), “Comparison of four methods to enumerate probiotic bifidobacteria in a fermented food product”,
Food microbiology, 23, p. 571-577.
22. Matsuki T, Watanabe K, Tanaka R, Fukuda M and Oyaizu H (1999), “Distribution of Bifidobacterial Species in Human Intestinal Microflora Examined with 16S rRNA-Gene-Tareted Species –Specifics Primers”,
Applied and Enviroment Microbiology, 65 (10), p. 4506-4512.
23.Promega Technical manual, pGEM-T and pGEM-T easy vector system, USA, 6/2009.
24. Schell MA, Karmirantzou M, Snel B, Vilanova D, Berger B, Pessi G, Zwahlen MC, Desiere F, Bork P, Delley M, Pridmore RD, Arigoni F (2002), “The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract”, Proc Natl Acad Sci U SA
99(22), p. 14422-14427.
25. Simpson. P.J, Fitzgerald.G.F, Stanton.C, Ross.R.P (2004), “ The evaluation of a mupirocin-based selective medium for the enumeration of bifidobacteria
from probiotic animal feed”, Journal of Microbiological Methods, 57(1), p. 9- 16.
26. Singh J, Rivenson. A, Tomita. M, Shimamura. S, Ishibashi. N, Reddy. B.S (1997), “Bifidobacterium longum, a lactic acid-producing intestinal bacterium inhibits colon cancer and modulates the intermediate biomarkers of colon carcinogenesis”, Carcinogenesis, 18(4), p.833–841.
27. Sul Sy, Kim HJ, Kim TW và Kim KY (2007), “Rapid Identification of Lactobacillus and Bifidobacterium in Probiotic Products Using Multiplex PCR”, J. Microbiol. Biotechnol, 17 (3), p.490-495.
77
28. Temmerman R, Pot B, Huys G, Swing J (2001), “A quality analysis of commercial probiotic products”, BiomedExperts 66 (3b), p. 535, 537-542. 29. Tuomola E, Crittenden R, Playne M, Isolauri E, and Salminen S(2001),
"Quality assurance criteria for probiotic bacteria", The American Journal of Clinical Nutrition, 73(2), p.393-398.
30. UELI VON AH (2006), Identification of Bifidobacterium thermophilum RBL67 isolated from baby faeces and partial purification of its bacteriocin, Zurich.
31.Wasilewska Ewa, Bielecka Maria, Markiewicz Lidia(2003), “Numerical analaysis of biochemical and morphological features of bifidobacteria as a tool for species characteristic and identification ”, Polish jounal of food and nutrition sciences, 12(53), p 149-156.