a. Tinh sạch DNA/dsRNA từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas.
Bộ kít GenJETTM Gel Extraction được thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn. Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA/dsRNA sợi đôi có kích thước từ 25 bp đến 20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb. Quy trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng bao gồm những bước như sau:
- Băng DNA/dsRNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ gel agarose và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml.
37
- Bổ sung đệm bám (binding buffer) với 1 thể tích bằng khối lượng miếng gel (1µl : 1 mg) và ủ trong bể ổn nhiệt 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn.
- Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng được gạn bỏ. - Bổ sung 500 µl đệm rửa (wash buffer) vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc
10000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ. Lặp lại bước này một lần nữa.
- Cột tinh sạch có chứa DNA/dsRNA được chuyển sang ống eppendorf 1,5 mới và bổ sung 100 µl elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột.
- Sau đó DNA/dsRNA được thu bằng cách ly tâm 1 phút với tốc độ 10000 vòng/phút.
Lượng DNA/dsRNA tinh sạch được giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.
b. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEMT-Easy cloning.
- Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT- Easy.
Các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu được nhân bản bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq polymerase, do đó sản phẩm PCR được tạo ra là các đoạn DNA có sẵn đầu A. Các đoạn DNA này dễ dàng ghép nối vào vector pGEMT-Easy có đầu T nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT-Easy đầu T được thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit, với các thành phần như trong Bảng 2.8
38
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector.
TT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm phản ứng 2X 10 µl
2 Sản phẩm PCR 3 µl
3 Vector đầu T pGEMT-T 1 µl 4 T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl 5 H2O cất khử ion vô trùng 5 µl
Tổng thể tích 20 µL
- Biến nạp DNA vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.
Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) được làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, bổ sung 10µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT-easy vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào được sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó được chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút. Tiếp theo, bổ sung 450µl LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 20 phút trước khi được nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml, phủ trên bề mặt cơ chất X-gal (20 l, nồng độ 20 mg/ml) và IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 20 l, nồng độ 100mM), ủ ở 37°C qua đêm.
c. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep. DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình được thực hiện như sau:
- Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm.
39
- Tế bào được thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Tế bào được hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNase A.
- Bổ sung 250 µl đệm P2 (lysis solution) vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid.
- Hỗn hợp được trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6 lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính được loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C.
- Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid được giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột được gạn bỏ.
- Bổ sung 500 µl đệm rửa (Wash buffer), ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bước này được lặp lại một lần nữa.
- Cột tinh sạch chứa plasmid được chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Plasmid được thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1 phút.
Mẫu plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C.