2.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng B. longum trong chế phẩm
Sử dụng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan, chúng tôi lựa chọn môi trường BSM agar để định lượng B. longum trong hỗn hợp [19], [25].
Chuẩn bị hỗn dịch thử: Cân và xác định khối lượng trung bình của 20 gói chế phẩm. Cân chính xác khoảng 10,0g bột thuốc vào bình nón vô trùng, thêm dung môi pha loãng với thể tích tính theo mililit bằng 9 lần khối lượng bột thuốc đã cân và vài viên bi thuỷ tinh vô trùng. Lắc mạnh trong 30 phút để vi sinh vật phân tán đều trong dung dịch, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1. Lấy 1000 l hỗn dịch trên cho
27
vào ống nghiệm đã chứa sẵn 9,0ml dung môi pha loãng, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex được hỗn dịch có độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng 10 lần như trên để thu được hỗn dịch có có độ pha loãng 10-5, 10-6 và 10-7.
Tiến hành: Chuẩn bị ba đĩa petri vô trùng, chuyển vào mỗi đĩa chính xác 1000 l hỗn dịch có độ pha loãng 10-5. Tiếp tục làm như trên với hỗn dịch có độ pha loãng 10-6 và 10-7. Cấy trộn với môi trường BSM đặc (đã được tiệt trùng và để nguội xuống khoảng 45oC), để môi trường trong đĩa đông tự nhiên. Lật ngược đĩa petri và ủ ở 37 1oC trong 48 - 72 giờ trong điều kiện kị khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc trong các đĩa petri (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 - 250).
Tính kết quả: Số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm được tính theo công thức:
A = nTB d MTB
Trong đó:
A : số lượng vi sinh vật trong 1 gói chế phẩm (CFU/gói), nTB : số lượng khuẩn lạc trung bình trong 3 đĩa petri (CFU),
MTB : khối lượng trung bình của bột thuốc trong gói chế phẩm (g/gói), d : hệ số pha loãng của hỗn dịch thử.
2.3.2. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A
2.3.2.1. Nguyên tắc chung
Kit API 20A là một hệ thống đã được tiêu chuẩn hóa của hãng BioMérieux (Pháp). Kit API 20A được dùng cùng với môi trường API 20A để định danh vi sinh vật kị khí, trong đó có chi Bifidobacterium.
Kit API 20A gồm 20 giếng chứa các chất nền khác nhau. Vi sinh vật cần xác định sẽ được cấy vào môi trường API 20A và nhỏ môi trường đã có vi sinh vật vào từng giếng, lúc này các chất nền trong giếng sẽ được hoà tan vào trong môi trường. Trong quá trình nuôi cấy sản phẩm chuyển hóa nếu có sẽ tự làm thay đổi màu môi trường hoặc thay đổi màu sau khi thêm thuốc thử. Tên của các chất nền sẽ được đề cập đến trong mục 2.3.2.2 13 .
28
2.3.2.2. Tiến hành
Sau khi nuôi cấy vi sinh vật như mô tả trong mục định lượng 2.3.1, lựa chọn một khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt và cấy chuyển sang 5,0ml môi trường MRS lỏng, có bổ sung khoảng 0,5ml dầu khoáng ở lớp bề mặt và ủ trong điều kiện kị khí ở 37
1oC trong 24 giờ.
a. Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.
Nếu vi sinh vật bắt màu tím, hình que, không có bào tử thì kết luận vi sinh vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử.
b. Định danh vi sinh vật bằng kit API 20A:
Sau khi xác định vi sinh vật là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử thì tiếp tục cấy một quai cấy canh chủng từ ống MRS lỏng ở trên lên môi trường thạch máu, ủ trong điều kiện kị khí ở 37 1oC trong 18-24 giờ. Gặt vi sinh vật trên bề mặt đĩa thạch và phân tán đều trong ống nghiệm có sẵn 1ml nước cất vô trùng thu được hỗn dịch gốc.
Nhỏ từ từ từng giọt hỗn dịch gốc ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 4ml nước cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn
McFarland số 3. Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên.
Cho vào 4ml môi trường API 20A số giọt hỗn dịch gốc bằng số giọt đã cho vào ống nghiệm trên và lắc đều. Như vậy, nồng độ vi sinh vật trong môi trường API 20A tương đương với độ đục chuẩn McFarland số 3 (so sánh độ đục bằng mắt thường).
Nhỏ môi trường API 20 đã cấy vi sinh vật vào các giếng của bộ kit API 20A bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 20, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng, chú ý chỉ nhỏ phần tube. Riêng đối với giếng IND nhỏ dung dịch dầu khoáng vô trùng lên trên bề mặt giếng để tạo điều kiện kị khí cho vi sinh vật phát triển. Đối với giếng GEL nhỏ cả phần tube và phần miệng giếng. Ủ ở 36 ± 2oC trong điều kiện kị khí trong vòng 24± 2h.
29
- Đối với giếng IND: Thêm 1 giọt thuốc thử XYL vào lớp dầu khoáng phía trên, trộn đều và để 2-3 phút. Sau đó thêm 1 giọt thuốc thử EHR. Đọc kết quả trong vòng 5 phút. Kết quả là dương tính nếu xuất hiện màu đỏ.
- Đối với các giếng có chứa các đường khác nhau: Thêm vào mỗi giếng một giọt thuốc thử BCP. Kết quả được ghi là dương tính nếu xuất hiện màu vàng hoặc vàng-xanh.
- Phản ứng CAT: Để kit tiếp xúc với không khí khoảng 30 phút, sau đó thêm 2 giọt thuốc thử H2O2 3% vào một giếng dương tính bất kỳ. Kết quả được ghi là dương tính nếu thấy xuất hiện bọt khí.
30
Bảng 2.4. Cách đọc kết quả kit Api 20A
Giếng Chất nền Hàm lượng(mg/gi ếng) Phản ứng Kết quả âm tính Dương tính
IND L-tryptophan 0,98 Sự hình thành indol
XYL-trộn đều /2-3 phút + HER/5 phút Vàng Đỏ URE Urea 0,648 Urease Vàng-cam Đỏ
GLU MAN LAC SAC MAL SAL XYL ARA D-glucose D-manitol D-lactose D-saccharose D-maltose Salicin D-xylose L-arabinose 1,96 1,96 1,96 1,86 1,96 1,64 1,64 1,64 Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa BCP Tím Vàng/ vàng-xanh GEL gelatin 0,6
Sự thủy phân gelatin
Không có sự khuếch tán chất màu Có sự khuếch tán chất màu đen ESC Esculin Sắt (III) citrat 0,36
0,11 Sự thủy phân Esculin
Vàng Nâu-đen Soi dưới đèn UV 365nm
Phát quang Không phát quang
GLY CEL MNE MLZ RAF SOR RHA TRE Glycerol D-cellobiose D-mannose D-melezitose D-raffinose D-sorbitol L-rhamnose D-trehalose 1,82 1,86 1,96 1,96 2,18 2,18 1,96 1,96 Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa Acid hóa BCP Tím Vàng/ Vàng-xanh
Sau khi tiếp xúc với không khí 30 phút, thêm H2O2 vào 1 giếng dương tính
CAT - Catalase Không có bọt khí Xuất hiện bọt khí
SPOR - Bào tử Không có Có
GRAM - Hồng Tím
31
Ghi kết quả vào phiếu theo dõi. Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.
2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự
2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự thuật PCR và giải trình tự
Sau khi lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng tách biệt, tiến hành tăng sinh trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 0,5ml dầu khoáng và được định danh đến chi
Bifidobacterium bằng kit API 20A như mô tả trong mục 2.3.2, tiếp tục cấy tăng sinh VSV từ phần sinh khối còn lại sang môi trường MRS lỏng, bổ sung thêm 0,5ml dầu khoáng vô khuẩn, ủ ở 37±10C trong điều kiện kỵ khí trong 24 giờ. Sau đó VSV trong ống môi trường MRS lỏng này sẽ được tách chiết DNA và định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự theo sơ đồ sau
Hình 2.1. Sơ đồ định tính B. longum bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự
VSV trong môi trường MRS lỏng Tách chiết DNA Kiểm tra sản phẩm tách Tiến hành phản ứng PCR với mồi đặc hiệu
Nhân dòng và giải trình tự
32
2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit
Nguyên tắc:
Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được phá vỡ nhờ lysozyme và dung dịch ly giải tế bào giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi sinh vật. Protein và RNA được tách khỏi hỗn hợp nhờ enzym RNAse và dung môi kết tủa protein. Cuối cùng DNA được tủa bằng Isopropanol.
DNA của các chủng nghiên cứu và của các vi sinh vật phân lập trong các mẫu được tách và tinh sạch bằng kit của Promega có cải tiến. Quy trình thực hiện như sau:
- Các chủng chuẩn được tăng sinh từ các ống gốc bằng môi trường MRS lỏng, ủ ở 370
C trong 48 giờ. Đối với các mẫu nghiên cứu, tiếp tục tăng sinh VSV trong môi trường MRS lỏng từ phần sinh khối của VSV được phân lập sau khi đã định danh đến chi Bifidobacterium (mục 2.3.2 )
- Lấy 1,0 – 1,5ml môi trường tăng sinh chủng trên vào ống nhựa 1,5ml. - Mang ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút loại dịch nổi thu lấy cắn. - Thêm 480µl dung dịch EDTA 50mM vào ống cắn, lắc đều.
- Thêm tiếp 120µl dung dịch lysozyme (nồng độ 20mg/ml) trộn đều.
- Ủ ở 370C trong 30-60 phút, sau đó ly tâm ở 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn.
- Thêm 600µl dung dịch Nuclei Lysis vào ống cắn vừa thu được. Dùng pipet đảo nhẹ tạo thành hỗn dịch.
- Ủ hỗn dịch trên ở 800
C trong 5 phút để ly giải tế bào, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng
- Thêm 3µl dung dịch RNAse vào dịch ly giải tế bào, trộn đều bằng cách đảo ống từ 5-7 phút.
- Ủ ở 370C trong 15-60 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Thêm 200µl dung dịch Protein Precipitation (dung dịch kết tủa protein) vào hỗn hợp trên, lắc mạnh trong 20 giây.
- Ủ trong đá lạnh 5 phút.
33
- Chuyển dịch nổi chứa DNA vào một ống nhựa 1,5ml sạch khác chứa 600µl
isopropanol. Trộn đều bằng cách đảo ngược ống từ 5-7 lần. - Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cắn. Thêm 600µl dung dịch ethanol 70% vào ống, đảo nhẹ nhàng để rửa cắn DNA.
- Ly tâm 10000-12000 vòng/phút trong 2 phút. Cẩn thận loại hết ethanol thừa, để khô tự nhiên trong 10-15 phút.
- Thêm 100µl dung dịch DNA Rehydration (dung dịch hòa tan DNA) vào ống chứa cắn DNA, ủ 650C trong 1 giờ.
- Bảo quản dung dịch DNA vừa tách được ở -200
C.
2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) bước sóng 260 nm (A260)
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) của các phân tử DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50 ng/µl, sử dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lượng DNA có trong mẫu tách chiết.
Tiến hành:
Lấy 20µl dung dịch DNA trên, thêm 1,98 ml nước cất siêu tinh khiết vô khuẩn. Tiến hành đo quang ở bước sóng 260nm thu được A260. Dựa vào kết quả đo tính toán nồng độ dung dịch DNA gốc rồi pha loãng dung dịch DNA gốc đến nồng độ 50 ng/µl.
2.3.3.4. Nghiên cứu, thiết kế mồi đặc hiệu
Trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu có liên quan, tham khảo nguồn gen của các loài vi sinh vật trên hệ thống ngân hàng gen thế giới (Genbank) và phần mềm Primer 3, NCBIblast. Từ đó nghiên cứu để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho đối tượng nghiên cứu.
34
Bảng 2.5. Trình tự các cặp mồi dung cho phản ứng PCR
Loài Tên mồi Trình tự
Kích thước gen đích Tài liệu tham khảo Đoạn 16S rDNA ID16R08 F 5’-GGGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’ 1500 bp [20] IDL16R0 9R 5’-GGGCTCGAGTACCTTGTTACGACTTCACC-3’ B. longum
BlonF 5’-TTC CAG TTG ATC GCA TGG TC-3’
831 bp [27],
[22]
BlonR 5’-GGG AAG CCG TAT CTC TAC GA-3’
Vector pGemT nguyên bản T7-Fw 5’ – AATACGACTCACTATAG – 3’ 186 bp [23] SP6-Rv 5’ – TATTTAGGTGACACTATAG – 3’
2.3.3.5. Kiểm tra khả năng tách DNA
16S ribosome RNA là một thành phần của các tiểu đơn vị 30s nhỏ trong ribosome vi khuẩn. Các gen mã hóa cho thành phần này được gọi là 16S rDNA có tính đặc thù cho vi khuẩn. Dựa trên tính chất này tiến hành phản ứng nhân bản đoan gen 16s rDNA bằng mồi đặc hiệu để chứng minh sự có mặt của DNA vi khuẩn. * Phản ứng PCR
Kiểm tra sản phẩm DNA tách được bằng phản ứng nhân bản đoạn gen đặc hiệu 16S rDNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.
35
Bảng 2.6. Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Đệm PCR (10X) 2,5 2 dNTPs (2mM) 2,5 3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75 4 ID16R08F (10 pmol) 1 5 IDL16R09R (10 pmol) 1 6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1 7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA: 940
C trong 5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 940
C trong 45 giây để làm biến tính DNA, 560C trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong 1 phút 30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 720C trong 5 phút và giữ ở 40C cho đến khi phân tích.
* Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị bản gel có nồng độ 1% (kl/tt) trong đệm TBE (pH 8,0) (Tris-Boric acid-EDTA), nhuộm sản phẩm theo kỹ thuật điện di trên gel giới thiệu ở mục
1.3.5.2 b, kèm theo một giếng nhỏ chứa thang kích thước DNA chuẩn. Điện di bằng máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 ở 100V trong 30 phút. Nhuộm sản phẩm bằng dung dịch ethidium bromide 0,1% trong 15-30 phút. Ghi lại kết quả bằng máy chụp ảnh bản gel UVDI- 312.
2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR thuật PCR
36 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR đơn mồi STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Đệm PCR (10X) 2,5 2 dNTPs (2mM) 2,5 3 Dung dịch MgCl2 (50mM) 0,75 4 BlonF (10pmol) 1 5 BlonR (10pmol) 1
6 Tag DNA polymerase (5u/µl) 0,1
7 DNA khuôn (50ng/µl) 3
8 Nước cất 14,15
Tổng thể tích phản ứng 25µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu: : 94o
C trong 5 phút để biến tính hoàn toàn DNA khuôn, tiếp theo là 30 chu kỳ của 3 bước: 940
C trong 45 giây để làm biến tính DNA, 56oC trong 45 giây để gắn mồi và 720C trong 30 giây để kéo dài chuỗi. Mẫu sau đó được ủ tiếp ở 72oC trong 5 phút và giữ ở 4o
C cho đến khi phân tích.
2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình tự
a. Tinh sạch DNA/dsRNA từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas.
Bộ kít GenJETTM Gel Extraction được thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn. Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA/dsRNA sợi đôi có kích thước từ 25 bp đến 20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb. Quy trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng bao gồm những bước như sau:
- Băng DNA/dsRNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ gel agarose và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml.
37
- Bổ sung đệm bám (binding buffer) với 1 thể tích bằng khối lượng miếng gel (1µl : 1 mg) và ủ trong bể ổn nhiệt 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn.
- Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm