a. Đánh giá độ đặc hiệu 1 2 1 n x x S n i i ri
42
Nguyên tắc: Trong cùng một phản ứng PCR tiến hành nhân bản đoạn gen đặc hiệu của đối tượng nghiên cứu với sự có mặt DNA của nhiều loài khác.
Bảng 2.10. Công thức tính độ đặc hiệu
Phép thử Chủng chuẩn Cộng
Dương tính Âm tính
Kỹ thuật PCR Dương tính a b a+b
Âm tính c d c+d
Cộng a+c b+d a+b+c+d
* Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/(số trường hợp âm tính thật +số trường hợp dương tính giả)=d/(b+d)
Quy trình được tiến hành như sau:
- Tách DNA từ chủng chuẩn B. longum JCM 1217 và các chủng kiểm tra độ đặc hiệu như quy trình ghi ở mục 2.3.3.2.
- Kiểm tra kết quả tách DNA như trong mục 2.3.3.5.
- Tiến hành thử nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu bằng phản ứng PCR với thành phần các ống thử nghiệm được ghi ở Bảng 2.7 ngoại trừ khuôn lần lượt là DNA của 20 chủng vi sinh vật chuẩn được ghi ở Bảng 2.3. Các điều kiện của phản ứng được ghi trong mục 2.3.3.5.
- Điện di DNA trên gel agarose
Tiến hành: Như mô tả trong mục 2.3.3.5
b. Đánh giá độ nhạy của phương pháp
Nguyên tắc: Tiến hành đánh giá ngưỡng phát hiện của toàn bộ quy trình phân tích bao gồm cả phần xử lý mẫu (tách DNA) và phân tích mẫu (phản ứng PCR) bằng cách pha một loạt hỗn dịch chủng có nồng độ giảm dần. Tiến hành quy trình phân tích và xác định nồng độ hỗn dịch nhỏ nhất còn lên kết quả phản ứng PCR.
Quy trình được tiến hành như sau:
- Tăng sinh chủng chuẩn B. longum JCM 1217 trong môi trường MRS lỏng sau 48 giờ trong điều kiện kỵ khí, đem ly tâm 3000 - 4000 vòng/phút trong
43
15 phút. Bỏ dịch nổi thu lấy cắn. Thêm vào ống nghiệm 2ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn trộn đều.
- Chuẩn bị một dãy ống nghiệm thủy tinh vô trùng, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,9 % vô khuẩn. Lấy 1ml hỗn dịch chủng ở trên thêm vào một ống nghiệm ở trên, lắc đều thu được hỗn địch có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng như vậy đến độ pha loãng 10-8.
- Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-6
, 10-7, 10-8, với mỗi độ pha loãng đếm số lượng vi khuẩn trên 2 đĩa. Cấy vào mỗi đĩa petri vô trùng 1ml hỗn dịch chủng ở độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8, thêm vào từng đĩa 15-20ml môi trường BSM agar vô trùng đã làm nguội đến 45-500C. Ủ ở 36-38o
C trong điều kiện kỵ khí. Sau 48 giờ đem ra đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa (chỉ đếm đĩa có 25-250 khuẩn lạc).
- Các ống hỗn dịch chủng trên được bảo quản ở 2-80
C. - Xác định số lượng vi khuẩn trong các ống pha loãng
X= ((N1 + N2)/2) x k Trong đó:
N1, N2: số khuẩn lạc trên từng đĩa. k: hệ số pha loãng tương ứng.
- Sau khi xác định được nồng độ của các chủng trong các ống hỗn dịch, tiến hành tách DNA theo quy trình ghi ở trong mục 2.3.3.2, thực hiện phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt như trong mục 2.3.3.6. Điện di sản phẩm trên gel agarose, xác định ống pha loãng cuối cùng còn lên phản ứng PCR chính là độ nhạy của phương pháp.
44
Bảng 2.11. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng của sản phẩm PCR
Tính chất băng điện di trên bản gel chạy điện di Đánh giá kết quả
Không có băng (-)
Băng DNA mờ hoặc chấm hạt thẳng hàng (+) Băng DNA nhỏ hoặc vừa, quan sát rõ (++) Băng DNA lớn, đậm, quan sát rất rõ (+++)
2.3.5. Ứng dụng quy trình chuẩn để định lƣợng và định tính B. longum
trong các chế phẩm probiotics đang lƣu hành trên thị trƣờng
Tiến hành định lượng, định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics được liệt kê trong phần đối tượng nghiên cứu theo quy trình đã xây dựng (Phụ lục 12). Khi tiến hành phản ứng PCR thí nghiệm được bố trí như sau:
- Một ống phản ứng PCR với DNA khuôn tách từ mẫu.
- Một ống phản ứng PCR với DNA khuôn của loài vi khuẩn chuẩn tương ứng (chứng dương tính)
- Một ống phản ứng PCR với nước cất siêu tinh khiết thay thế cho phần dung dịch ADN khuôn (chứng âm tính)
45
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU