Trong các nhóm hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có tác dụng chống viêm, flavonoid nổi bật lên là nhóm có tác dụng chống viêm mạnh, cả tác dụng chống viêm cấp và chống viêm mạn. Tectorigenin là một flavonoid và là thành phần chính có hoạt tính trong xạ can - vị thuốc cũng được sử dụng chủ yếu để chữa nhiều bệnh liên quan đến viêm như viêm họng cấp và mạn, viêm amidan...[24]. Thêm vào đó, trên thế giới tectorigenin đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm in vitro [35],[46]. Từ những cơ sở trên, chúng tôi đã lựa chọn tìm hiểu tác dụng sinh học đầu tiên của TEC-01 là tác dụng chống viêm. Chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng chống viêm của TEC-01 trên cả mô hình gây viêm cấp (gây phù bàn chân chuột bằng carragenin) và mô hình gây viêm mạn (gây u hạt thực nghiệm bằng amian).
4.2.1. Về tác dụng chống viêm của TEC-01 trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin
Chúng tôi lựa chọn mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin để đánh giá tác dụng chống viêm cấp. So với các mô hình chống viêm cấp và bán cấp khác thì mô hình gây phù chân chuột là đơn giản, dễ dàng thực hiện hơn, và phù hợp cho cả mục đích sàng lọc lẫn nghiên cứu sâu. Đây cũng là mô hình được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam để đánh giá tác dụng chống viêm.
Chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 ở mức liều là 60 mg/kg cho chuột cống trắng (tương đương liều chuột nhắt trắng 100mg/kg).
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.6 cho thấy: sau khi gây viêm bằng caragenin, mức độ phù chân chuột ở lô uống TEC-01 tại thời diểm 5 giờ (19,70 ± 6,62) và 7 giờ (20,40 ± 6,32) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (5 giờ: 46,93 ± 5,86; 7 giờ: 62,41 ± 6,64); p<0,05. Tác dụng chống viêm này không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô uống indomethacin liều 10 mg/kg (5 giờ: 25,34 ± 3,17; 7 giờ: 34,72 ± 4,36); p>0,05.
Trong, mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin, quá trình viêm diễn ra theo hai pha. Pha đầu tiên bắt đầu ngay sau khi tiêm và giảm xuống nhanh trong vòng 1 giờ đầu. Pha này giải phóng ra histamin và serotonin. Pha thứ hai bắt đầu sau khi kết thúc pha một và giải phóng ra các PG, protease và lysosom. Hầu hết các thuốc có tác dụng chống viêm đều có tác dụng trên pha hai [28],[59]. TEC-01 cũng thể hiện tác dụng chống viêm trên pha hai: thuốc tác dụng tốt nhất ở khoảng 5-7 giờ sau khi gây viêm. So sánh với tectorigenin, nhiều flavonoid cũng có đáp ứng tương tự với mô hình này như: queretin ở liều 75mg/kg, hesperidin liều 80mg/kg, kaemferol glycosid...[54].
Như vậy, TEC-01 liều 60mg/kg có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin ở thời điểm 5-7 giờ, tác dụng này tương đương với indomethacin liều 10mg/kg.
4.2.2. Tác dụng chống viêm mạn của TEC-01 trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian
Khi đưa vào cơ thể các tác nhân gây viêm trơ như bông, amian, chất dẻo… không có khả năng tiêu đi bởi quá trình viêm thì cơ thể phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào xung quanh dị vật và tạo thành u hạt. Về tổ chức học, u hạt là nơi tập trung nhiều loại tế bào như bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu hạt ưa base, tế bào dạng biểu mô, nguyên bào sợi… Khi u hạt hình thành, quá trình viêm đã đi vào giai đoạn mạn tính mà đặc trưng là có sự tham gia tích cực của các loại tế bào. Các thuốc có khả năng ức chế sự phát triển của u hạt được xem như có tác dụng chống viêm mạn trên động vật thực nghiệm.
Dựa vào các nghiên cứu trước đó của Đỗ Trung Đàm và một số nghiên cứu khác, chúng tôi đã lựa chọn mô hình gây hình u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng để nghiên cứu chống viêm mạn của TEC-01 [15],[16]. Việc sử dụng amian gây viêm có nhiều ưu điểm:
+ Rất trơ
+ Dễ tạo hình dáng, kích thước + Trọng lượng khối u đồng đều + Dễ bóc tách
Qua kết quả ở bảng 3.7 cho thấy: TEC-01 có tác dụng chống viêm mạn, với tỷ lệ ức chế u hạt là 35,67% khi cân khối lượng ướt, và 43,54% khi cân khối lượng khô so vơi lô chứng. Tác dụng này tương đương với tỷ lệ ức chế của prednisolon liều 5 mg/kg (cân ướt: 42,53%; cân khô: 44,55%) với p > 0,05.
Tác dụng chống viêm mạn cũng đã được quan sát thấy ở nhiều flavonoid. Các flavonoid có cấu trúc vòng B giống catechol hoặc guaiacol có khả năng ức chế u hạt mạnh hơn các flavonid khác [49]. Trong nghiên cứu của Guardia T. và cộng sự, rutin, quercetin và hesperidin đều thể hiện tác dụng chống viêm mạn, đặc biệt rutin làm giảm mức độ phù, hình thành hạt và mức độ cứng khớp trên mô hình gây viêm khớp ở chuột [32].
Như vậy, TEC-01 liều 60mg/kg có tác dụng chống viêm trên cả mô hình gây viêm cấp và mô hình gây viêm mạn. Kết quả này rất phù hợp với các nghiên cứu về tác dụng chống viêm in vitro của tectorigenin trên thế giới.
Theo các tài liệu đã công bố, cơ chế chống viêm của tectorigenin có liên quan tới sự ức chế sản xuất PGE2. Trong các phản ứng viêm các PG được tạo thành từ acid arachidonic theo con đường COX. COX -1 chịu trách nhiệm tổng hợp các PG sinh lý tham gia vào chức năng bình thường của cơ thể. COX-2 là một enzym tiền viêm có vai trò tạo ra các PG gây viêm. Bình thường hoạt tính của COX-2 rất thấp trong tế bào. Trong các mô viêm, kích thích viêm gây cảm ứng tế bào, hoạt hóa mạnh COX-2 và nồng độ COX-2 có thể tăng cao tới gấp 80 lần bình thường [7],[25]. Trong nghiên cứu của Kim Y P. và cộng sự, tectorigenin không ảnh hưởng tới hoạt tính của COX-1 và COX-2, tuy nhiên chất này lại ức chế sự cảm ứng của COX-2 gây ra bởi TPA hoặc thapsigargin ở đại thực bào phúc mạc chuột, do đó ức chế sự hình thành PGE2 [35].
Ngoài ra, cơ chế chống viêm của tectorigenin còn liên quan đến việc ức chế tạo thành NO và IL-1β. Trong viêm, NO gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, tăng sản xuất các PG viêm, gây độc tế bào với một số vi khuẩn, nấm... NO được tạo thành do enzym NOS trong đó chủ yếu là NOS cảm ứng (iNOS) tham gia vào các phản ứng viêm [51]. Tectorigenin ức chế sự tạo thành NO do ức chế iNOS [61]. IL-1β cũng là một chất trung gian trong viêm
có tác dụng kích thích sinh sản lympho T, tổng hợp PG, bộc lộ các phân tử dính của tế bào nội mô [22]. Tectorigenin ức chế đáng kể sự tạo thành IL-1β ở đại thực bào Raw 264.7 bị kích thích bởi IFNγ/lipopolysacharid. Bên cạnh đó, tectorigenin còn ức chế sự hoạt hóa của NF-κB ở đại thực bào do ức chế sự giáng hóa IκB-α; và do đó ức chế sự sao chép và sản xuất iNOS, COX-2, NO, các cytokin tiền viêm [46].
4.3. BÀN LUẬN VỀ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU CỦA TEC-01
Quá trình viêm sẽ gây ra đau nên có nhiều thuốc có tác dụng chống viêm cũng có tác dụng giảm đau. Nhiều flavonoid vừa có tác dụng chống viêm, vừa có tác dụng giảm đau như quercetin, myricitrin ...[27],[50]. Vị thuốc xạ can cũng được sử dụng chữa bệnh liên quan đến đau như đau bụng kinh...[24]. Chính vì vậy, sau khi quan sát được tác dụng chống viêm của TEC-01 - flavonoid chính trong xạ can, chúng tôi đã lựa chọn đánh giá tác dụng giảm đau của hoạt chất này.
Tác dụng giảm đau của TEC-01được thử nghiệm trên hai mô hình: mô hình gây đau quặn bằng acid acetic và mô hình gây đau bằng phiến nóng.
4.3.1. Về tác dụng giảm đau của TEC-01 trên chuột nhắt gây đau quặn bằng acid acetic
Mô hình gây đau quặn trên chuột nhắt bằng acid acetic là một mô hình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi của các thuốc. Mặc dù mô hình này không có tính chọn lọc vì có nhiều chất khác nhau đáp ứng với mô hình này (ví dụ: các thuốc kháng cholinergic, các thuốc chống trầm cảm ba vòng, các thuốc kháng histamin…), nó vẫn được sử dụng rộng rãi để sàng lọc, đánh giá tác dụng giảm đau của các thuốc [60].
Từ kết quả tại bảng 3.8 cho thấy: khi dùng liều 100 mg TEC-01/kg, số cơn đau quặn của chuột đã giảm trong khoảng từ 5-30 phút (5-10 phút: 11,13 ± 0,33; 10-15 phút: 7,14 ± 0,54; 15-20 phút: 8,41 ± 0,33; 20-25 phút: 7,14 ±
0,40; 25-30 phút: 6,17 ± 0,28) so với lô chứng (5-10 phút: 18,00 ± 0,47; 10- 15 phút: 18,10±0,39; 15-20 phút: 13,77±0,35; 20-25 phút: 14,00± 0,28; 25-30 phút: 11,37 ± 0,32); p < 0,05. So sánh với lô chứng dương, hiệu quả giảm đau này tương đương với tác dụng của aspirin liều 240 mg/kg (p > 0,05).
Mô hình gây đau quặn liên quan đến các receptor phúc mạc tại chỗ (receptor cholinergic, receptor histamin) các chất trung gian, acetylcholine và histamin. Ngoài ra nó còn liên quan đến sự tăng mức PGE2 và PGF2α ở dịch màng bụng. Con đường quan trọng nhất dẫn truyền sự đau do viêm là sự nhạy cảm của các receptor nhận cảm đau ngoại vi với các proton (như là các kênh ion nhạy cảm với acid) và với các chất gây đau (như bradykinin và cytokine). Các receptor này sẽ truyền tín hiệu về thần kinh trung ương thông qua sợi C. Thêm vào đó sự đáp ứng đau gây ra bởi acid acetic còn phụ thuộc vào một số cytokine như TNFα, interleukin-1 và interleukin-8 thông qua sự điều biến của đại thực bào và tế bào mast khu trú ở khoang màng bụng [26],[43],[50],[58]. Theo nghiên cứu của Kim YP và cộng sự, tectorigenin có tác dụng ức chế sản xuất PGE2 và ức chế sự cảm ứng của COX-2 ở đại thực bào phúc mạc chuột. Có thể đây là một trong các cơ chế góp phần tạo ra tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình này [35].
Như vậy, liều 100mg TEC-01/kg chuột nhắt trắng có tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau quặn ngay sau khi tiêm acid acetic 5 phút, tác dụng này tương đương với aspirin liều 240mg/kg.
4.3.2. Tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình gây đau bằng phiến nóng nóng
Thí nghiệm trên đã cho thấy tác dụng giảm đau ngoại vi của TEC-01. Ngoài tác dụng giảm đau ngoại vi, nhiều flavonoid còn thể hiện tác dụng giảm đau theo cơ chế trung ương. Dịch chiết từ Pueraria thunbergiana và một số dược liệu (trong dịch chiết có chứa tectorigenin) cũng được quan sát
thấy có tác dụng giảm đau theo cơ chế trung ương [36]. Vì vậy, để tìm hiểu thêm liệu TEC-01 có tác dụng giảm đau theo cơ chế trung ương hay không, chúng tôi tiến hành thử nghiệm thêm tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình phiến nóng. Đây là một mô hình đơn giản, dễ thực hiện, thời gian nghiên cứu ngắn và dễ áp dụng tại Việt Nam.
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy: thời gian đáp ứng của chuột với lô sử dụng morphin cao hơn hẳn so với các lô còn lại; thời gian đáp ứng đau của lô uống TEC-01 liều 100 mg/kg và lô uống NaCl 0.9% là tương đương nhau. Như vậy, với mức liều 100mg/kg chuột nhắt trắng, TEC-01 không có tác dụng giảm đau trên mô hình giảm đau phiến nóng.
Từ kết quả thí nghiệm trên hai mô hình giảm đau, có thể đi đến kết luận: TEC-01 có tác dụng giảm đau với mức liều 100mg/kg, tuy nhiên ở mức liều này TEC-01 chưa thể hiện tác dụng giảm đau theo cơ chế trung ương.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên về độc tính và tác dụng giảm đau, chống viêm của TEC-01, chúng tôi xin đưa ra một số kết luận sau:
1. Về độc tính 1.1. Độc tính cấp.
LD50 = 1,735 (1,449-1,990) g/kg chuột nhắt trắng.
1.2. Độc tính bán trường diễn:
TEC-01 liều 100mg TEC-01/kg/ngày và 300mg TEC-01/kg/ngày cho chuột nhắt trắng uống liên tục trong 28 ngày, chưa thấy ảnh hưởng đến tình trạng chung, sự gia tăng khối lượng cơ thể , các chỉ số huyết học, chức năng gan và thận của chuột.
2. Về tác dụng chống viêm của TEC-01
2.1. Tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin
TEC-01 với mức liều 60 mg/kg chuột cống trắng thể hiện tác dụng chống viêm cấp thông qua sự giảm mức độ phù chân chuột ở lô uống thuốc thử tại thời diểm 5 giờ (19,70 ± 6,62) và 7 giờ (20,40 ± 6,32) so với lô chứng (5 giờ: 46,93 ± 5,86; 7 giờ: 62,41 ± 6,64); p < 0,05. Tác dụng chống viêm này tương đương với tác dụng chống viêm của indomethacin liều 10 mg/kg (p>0,05).
2.2. Tác dụng chống viêm mạn của TEC-01 trên mô hình gây u hạt bằng amian
Liều 60 mg TEC-01/kg thể hiện tác dụng chống viêm thông qua sự giảm khối lượng u hạt so với lô chứng (cân ướt: 35,67%, cân khô: 43,54%); p < 0,05. Tác dụng này tương đương với tác dụng của prednisolon liều 5 mg/kg (p>0,05).
3. Về tác dụng giảm đau của TEC-01
3.1. Tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic.
TEC-01 ở mức liều 100mg/kg chuột nhắt trắng đã làm giảm số cơn đau quặn trên chuột thực nghiệm so với lô chứng ở các thời điểm từ 5-30 phút (lô thử: 11,13 ± 0,33 (5-10’), 7,14 ± 0,54 (10-15’), 8,41 ± 0,33 (15-20’), 7,14 ± 0,40 (20-25’), 6,17 ± 0,28 (25-30’); lô chứng: 18,00 ± 0,47 (5-10’), 18,10 ± 0,39 (10-15’), 13,77±0,35 (15-20’), 14,00 ± 0,28 (20-25’), 11,37± 0,32 (25- 30’); p<0,05) . Tác dụng này tương đương với tác dụng của aspirin liều 240 mg/kg.
3.2. Tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình giảm đau phiến nóng
Với liều 100 mg/kg chuột nhắt trắng, TEC-01 không thể hiện tác dụng giảm đau trên mô hình giảm đau phiến nóng.
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả của quá trình thực nghiệm, chúng tôi đưa ra đề xuất như sau: 1. Đánh giá độc tính bán trường diễn của TEC-01 trên các loài động vật
khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt:
1. Bộ môn Dược liệu - trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Bài giảng dược liệu, NXB Y học.
2. Bộ môn Dược lực - trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Dược lý học, tập 1, NXB Y học, tr 105-116.
3. Bộ môn Dược lực - trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Dược lý học, tập 2, NXB Y học, tr 231-244, 255-260.
4. Bộ môn Dược lý - trường Đại học Y Hà Nội (2008), Dược lý học lâm sàng, NXB Y học, tr 166-168, 597-600.
5. Bộ môn Dược lý - trường Đại học Y Hà Nội (2003), Dược lý học, NXB Y học, tr 492-493.
6. Bộ môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Hóa sinh 2, NXB Y học.
7. Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh - trường đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (1999), Miễn dịch sinh lý bệnh, tập 1, NXB Thành phố Hồ Chí Minh, tr 120-133.
8. Bộ môn Miễn dịch - sinh lý bệnh - trường đại học Y Hà Nội (2008), Sinh lý bệnh, NXB Y học, tr 209-229.
9. Bộ môn sinh lý bệnh - trường Đại học Y Hà Nội (1990), Bài giảng sinh lý bệnh, NXB Y học, tr 62-66.
10. Bộ môn sinh lý học - trường Đại học Y Hà Nội (2006), Sinh lý học, tập 2, NXB Y học.
11. Bộ môn sinh lý học - trường Đại học Y Hà Nội (1997), Chuyên đề sinh lý học, tr 138-153.
12. Bộ Y tế - Viện Kiểm nghiêm (2005), Dự thảo hướng dẫn thử độc tính của
13. Đỗ Trung Đàm (1997), Đau và thuốc giảm đau, Tạp chí Dược lâm sàng, số 4, tr97-100.
14. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, NXB Y học.
15. Đỗ Trung Đàm (1996), Tác dụng chống viêm mạn tính của bài thuốc chữa
thấp khớp SASP - 5221, Tạp chí Dược học, số 10, tr 23.
16. Mai Lê Hoa và cộng sự (1998), Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây lão quan thảo di thực ở Việt Nam (Geranium th unbergii Sieb. Et zucc.,