Trong những năm gần đây, trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của tectorigenin được công bố.
* Về tác dụng chống viêm của tectorigenin
Kim YP và cộng sự đã quan sát được tác dụng ức chế sản xuất PGE2 do ức chế sự cảm ứng enzym COX-2 ở đại thực bào phúc mạc chuột. Các chất này ức chế chọn lọc trên COX-2 mà không ức chế COX-1. Điều này gợi ý rằng cơ chế chống viêm của tectorigenin là ức chế sản xuất PGE2 do ức chế chọn lọc COX-2 ở các tế bào viêm [52]. Nghiên cứu sâu hơn Cheol-Ho và cộng sự thấy rằng tectorigenin có khả năng ức chế sự hình thành của NO, COX- 2, PGE2, IL-1β bị cảm ứng bởi IFN-γ/LPS thông qua biểu hiện gen. Tác dụng ức chế này là do tectorigenin đã khóa NF-κB hoạt hóa ở đại thực bào [46].
* Các tác dụng khác
Jun SH và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng ức chế mạnh enzym aldose reductase của tectorigenin, do đó có thể ngăn chặn được các biến chứng của đái tháo đường trên mô hình chuột gây đái tháo đường do streptozocin. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, tectorigenin có tác dụng ức chế sự tích luỹ sorbitol ở các vị trí như thuỷ tinh thể, dây thần kinh hông hay tế bào hồng cầu [33].
Jens-Gerd Scharf và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng ức chế khối u trên chuột thực nghiệm của tectorigenin và các chất khác từ dịch chiết của thân rễ xạ can. Cụ thể: tectorigenin có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt. Cơ chế có thể do tectorigenin có tác dụng sửa chữa những bất thường trong biểu hiện một số gen liên quan đến ung thư tuyến tiền liệt. Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy tectorigenin trong tương lai có thể được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị ung thư tuyến tiền liệt [57].
Tectorigenin có tác dụng làm giảm sự tăng sinh của các tế bào HSC-T6 phụ thuộc vào thời gian và liều dùng. Thêm vào đó, tectorigenin gây ra sự chết theo chương trình của các tế bào HSC-T6 và có khả năng chống lại sự hình thành xơ (trong xơ gan, tính chất đặc trưng nhất là dư thừa collagen type I; các tế bào hình sao hoạt hóa (HSC) là các tế bào chịu trách nhiệm chính về việc sản xuất dư thừa collagen) [63].
Tectorigenin ức chế sự tăng sinh của các nguyên bào sợi ở phổi và tăng hoạt hóa miR-338*. Điều này cho thấy tectorigenin có thể có khả năng ức chế bệnh sinh của xơ hóa phổi vô căn [64].
Wozniak D và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chống đột biến và chống oxy hoá của các isoflavonoid từ xạ can [62].
Lee HU và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của tectorigenin trên tế bào gan bị gây độc bởi tert-butyl hyperoxide [40].
Satoru Tamura và cộng sự đã quan sát thấy khả năng ức chế sự biểu hiện của receptor IgE trên tế bào mast của người. Receptor của IgE (FcεRI) chính là chìa khóa phân tử để kích hoạt các phản ứng dị ứng thông qua IgE. Receptor này có 3 tiểu đơn vị là α, β, γ; tectorigenin làm giảm sự hình thành của tiểu đơn vị γ nên làm giảm biểu hiện của FcεRI. Tectorigenin được phát hiện là chất ức chế mạnh nhất trong số các chất của 400 dược liệu khác nhau được khảo sát. Đây có thể là một hướng nghiên cứu mới về các thuốc dị ứng [56].
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thuốc nghiên cứu
Chế phẩm TEC-01 (thành phần chính là tectorigenin) do phòng Hóa Dược, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam chiết tách từ thân rễ cây Xạ can (Belamcanda chinensis) thu tại Vườn Quốc gia Tam Đảo, Việt Nam cung cấp.
- Quy trình chiết tách như sau:
Hình 2.5. Quy trình chiết tách TEC-01 Thân rễ xạ can
Cắn chiết ethanol
Dịch chiết nước
Cắn chiết ethyl acetat
+ Ethanol 70, cất loại dung môi
+ nước, chiết loại béo với n-hexan
+ pH = 3-4, chiết với ethyl acetat
Tách bằng sắc ký cột, SiO2 DM 25:1
Phân đoạn isoflavonoid
- Tiêu chuẩn thành phẩm:
+ Tính chất: bột màu vàng nhạt. + Thành phần: 95% là tectorigenin.
2.1.2. Súc vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, có trọng lượng 20 - 22g do viện Vệ sinh dịch tễ TW cung cấp.
- Chuột cống trắng, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 180-200g, do học viện Quân Y cung cấp.
- Động vật thí nghiệm sau khi mua được nuôi dưỡng theo chế độ tiêu chuẩn, cho ăn thức ăn do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp và cho uống nước tự do tại phòng nuôi động vật thí nghiệm bộ môn Dược lực, trường đại học Dược Hà Nội.
2.1.3. Hoá chất, thuốc thử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Indomethacin bột tinh khiết lọ 200 mg do viện Kiểm Nghệm - Bộ Y tế sản xuất.
- Morphin hydroclorid, ống tiêm 10 mg/ml do công ty Cổ phần dược phẩm Vĩnh Phúc sản xuất.
- Aspegic, bột pha uống hàm lượng 100 mg/gói, do công ty Sanofi Synthelabo sản xuất.
- Prednisolon lọ 125 mg do viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế sản xuất.
- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hóa trong máu: ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), cholesterol toàn phần, protein toàn phần và creatinin là hoá chất của hãng Teco Diagnostics (Mỹ)
- Các hoá chất khác đạt độ tinh khiết hóa học.
2.1.4. Máy móc thiết bị nghiên cứu
- Tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm Memmert.
TEC-01 Nghiên cứu độc tính Nghiên cứu tác dụng chống viêm Nghiên cứu tác dụng giảm đau Độc
tính cấp Độc tính bán trường diễn đau quặn Giảm phiến nóng Giảm đau viêm cấp Chống viêm mạn Chống - Dụng cụ đo thể tích chân chuột: thiết bị Plethymometer model 7140, hãng Ugo basile.
- Máy LE 7406 Hot plate, hãng Letica Scientific Instruments, Tây Ban Nha.
- Máy sinh hoá TC 84 plus của hãng Teco Diagnostics (Mỹ). - Máy huyết học poCH-100i của hãng Sysmex (Nhật Bản).
- Máy móc và dụng cụ thí nghiệm khác thuộc bộ môn Dược lực - trường đại học Dược Hà Nội.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu (sơ đồ mô hình nghiên cứu):
Hình 2.6. Sơ đồ mô hình nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu độc tính
2.2.1.1. Nghiên cứu độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo đường uống [12],[14],[44].
Chuột thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, sau đó chia ngẫu nhiên chuột thành 5 lô, mỗi lô 10 con.
Trước khi tiến hành thí nghiệm 12 giờ, cho chuột nhịn đói nhưng được cho uống nước đầy đủ.
Tiến hành thí nghiệm: cho từng lô chuột uống thuốc thử TEC-01 với mức liều từ cao nhất không gây chết tới mức liều thấp nhất gây chết. Theo dõi chuột liên tục trong vòng 4h, tỉ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi uống TEC-01.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu...
- Tỉ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi thử nghiệm.
- Khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể cơ quan phủ tạng. Nếu cần, làm vi thể xác định nguyên nhân.
- Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon. 2.2.1.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành trên chuột nhắt trắng [12],[45].
Chuột thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, sau đó chia ngẫu chuột thành 3 lô, mỗi lô 30 con.
- Lô chứng: cho uống dung dịch NaCMC 1%. - Lô thử 1: uống TEC-01 với liều 100 mg/kg. - Lô thử 2: uống TEC-01 với liều 300 mg/kg. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TEC-01 được pha trong dung dịch NaCMC 1% để đảm bảo thể tích cho uống đồng đều ở tất cả các lô (0,2ml/10g chuột).
Chuột nhắt trắng được cho uống dung dịch NaCMC 1% hoặc TEC-01 hàng ngày vào khoảng 9 giờ sáng, liên tục trong 28 ngày. Tại 3 thời điểm: trước uống thuốc, sau 14 ngày và 28 ngày uống thuốc; giết chuột (mỗi thời điểm 10 con/lô) và lấy máu để đánh giá các chỉ tiêu:
- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua các chỉ số: số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu.
- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và chất chuyển hoá trong máu: AST, ALT, protein toàn phần, cholesterol.
- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng creatinin trong máu. Sau 28 ngày cho uống thuốc liên tục, giết ngẫu nhiên 30% số chuột trong mỗi lô, mổ chuột để quan sát đại thể và cấu trúc vi thể gan, thận.
2.2.2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm
2.2.2.1. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp
Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng carragenin [61].
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con. - Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống indomethacin với liều 10mg/kg. - Lô 3 (lô thử): uống TEC-01 với liều 60 mg/kg.
Chuột được uống thuốc trước khi gây viêm 1 giờ. Tiến hành gây viêm bằng cách tiêm 0.1 ml carragenin 1% vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột.
Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) vào các thời điểm: trước khi gây viêm, sau khi gây viêm 1 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 24 giờ.
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.7. Sơ đồ đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình gây viêm bằng carragenin.
Mức độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức của Fontaine:
∆V (%) = (Vt – V0)/ V0× 100 Trong đó V0 : thể tích chân chuột trước khi gây viêm. Vt : thể tích chân chuột sau khi gây viêm. ∆V: độ tăng thể tích chân chuột.
2.2.2.2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn
Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của TEC-01 trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian [15],[16],[60].
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 9 con.
Gây viêm mạn bằng cách cấy viên amian (30±1mg/con chuột) đã được tiệt trùng (ở 1200C trong 2 giờ).
Sau khi cấy u hạt, cho chuột uống liên tục 7 ngày: - Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống prednisolon với liều 5mg/kg. - Lô 3 (lô thuốc thử): uống TEC-01 với liều 60mg/kg.
Ngày thứ 8 tiến hành giết chuột bằng ether, bóc tách u hạt, cân khối lượng ướt của u hạt rồi đem sấy ở 600C đến khối lượng không đổi (khoảng 18 giờ). Cân u hạt khô.
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt bằng amian.
I% = (Tc - Tt)/Tc × 100
Trong đó Tc: trọng lượng trung bình khối u hạt lô chứng trắng. Tt: trọng lượng trung bình khối u hạt lô thử.
I: tỷ lệ ức chế u hạt.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng giảm đau
2.2.3.1. Nghiên cứu tác dụng giảm đau quặn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic [38].
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống aspirin với liều 240 mg/kg. - Lô 3 (lô thuốc thử): uống TEC-01 với liều 100 mg/kg.
Cho chuột uống thuốc, 30 phút sau tiêm màng bụng 0.1 ml acid acetic 1% cho mỗi chuột. Đếm số cơn đau quặn trong từng khoảng thời gian 5 phút một, kể từ ngay sau khi tiêm acid acetic và theo dõi liên tục trong vòng 30 phút. Biểu hiện của cơn đau quặn là cơ bụng co lại và chi sau duỗi thẳng.
Cách đánh giá kết quả: so sánh số cơn đau quặn đếm được ở lô uống TEC-01 so với các lô chứng tại cùng một khoảng thời gian để đánh giá tác dụng giảm đau của thuốc thử.
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.9. Sơ đồ quy trình thí nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình giảm đau quặn.
2.2.3.2. Nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình gây đau bằng phiến nóng
Đặt chuột nhắt trên tấm kim loại duy trì ở nhiệt độ 55±0.20C. Ghi lại thời gian chuột có phản ứng đầu tiên (nhảy lên hoặc liếm chân sau) bằng đồng hồ đếm giây, chọn những con có thời gian đáp ứng từ 8 đến 30 giây. Chia ngẫu nhiên số chuột được chọn thành 3 lô, mỗi lô 10 con.
- Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%. - Lô 2 (lô thử): uống TEC-01 với liều 100mg/kg.
- Lô 3: tiêm màng bụng dung dịch morphin với liều 6mg/kg.
Tiếp tục ghi lại thời gian phản ứng của chuột tại các thời điểm 1/2 giờ, 1 giờ, 2 giờ tính từ lúc cho chuột uống hoặc tiêm thuốc [60].
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.10. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình giảm đau phiến nóng.
2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các giá trị được mô tả dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn), số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp one-way ANOVA trên phần mềm SPSS 17.0 để so sánh giá trị trung bình các lô.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CỦA TEC-01 3.1.1. Nghiên cứu độc tính cấp 3.1.1. Nghiên cứu độc tính cấp
- Kết quả thăm dò các mức liều thử cho thấy, sau 24 giờ uống thuốc ở mức liều 1000 mg TEC-01/kg chuột không gây chết chuột; với mức liều 3000 mg TEC-01/kg chuột gây chết 100% chuột.
- Dựa trên kết quả thăm dò thực nghiệm chính thức được bố trí như sau: chuột nhắt trắng 50 con, nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm 05 ngày được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con. Cho lần lượt từng lô chuột uống dung dịch TEC-01với mức liều từ 1000mg/kg chuột đến 3000mg/kg chuột. Pha TEC-01vào dung dịch MaCMC 1% để đảm bảo thể tích thuốc mỗi lần cho chuột uống là 0,2ml/10g chuột.
Bảng 3.1.Kết quả thử độc tính cấp của TEC-01 trên chuột nhắt trắng
Lô Liều dùng (mg/kg) Số chuột/lô (n) Số chuột chết trong vòng 72 giờ Tỉ lệ % chuột chết 1 1000 10 0 0 2 1500 10 4 40 3 2000 10 7 70 4 2500 10 8 80 5 3000 10 10 100
- Từ tỉ lệ % chuột chết của từng lô, tính LD50 theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon, kết quả như sau:
Nhận xét:
- Khoảng 1 - 2 giờ sau khi uống TEC-01: một số chuột có biểu hiện thở gấp, co giật và chết.
- Khoảng 24 - 48 giờ sau khi uống TEC-01: thêm một số chuột chết. - Sau 48 giờ: số chuột sống sót đều ăn uống hoạt động bình thường, không có biểu hiện ngộ độc.
3.1.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
3.1.2.1 Ảnh hưởng của TEC-01 tới tình trạng chung và thể trọng chuột Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống, hoạt động Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống, hoạt động bình thường, phản xạ nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, phân khô, không thấy có biểu hiện bất thường.
Chuột nhắt trắng được cân ở ngày thứ 14 và 28 trong quá trình thực nghiệm. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của TEC-01 đến cân nặng của chuột (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời điểm nghiên cứu Lô chứng n= 10 Lô thử 1 n= 10 Lô thử 2 n= 10 p (so với lô
chứng) N0 24,00 ±0,53 25,98 ±0,63 25,94 ±0,29 > 0,05 N14 26,40 ±0,52 ptr/s < 0,05 28,75 ±0,64 ptr/s < 0,05 28,38 ±0,51 ptr/s < 0,05 > 0,05 N28 27,96 ±0,79 ptr/s < 0,01 33,76 ±0,97 ptr/s < 0,01