Nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo đường uống [12],[14],[44].
Chuột thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, sau đó chia ngẫu nhiên chuột thành 5 lô, mỗi lô 10 con.
Trước khi tiến hành thí nghiệm 12 giờ, cho chuột nhịn đói nhưng được cho uống nước đầy đủ.
Tiến hành thí nghiệm: cho từng lô chuột uống thuốc thử TEC-01 với mức liều từ cao nhất không gây chết tới mức liều thấp nhất gây chết. Theo dõi chuột liên tục trong vòng 4h, tỉ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi uống TEC-01.
Các chỉ tiêu theo dõi:
- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu...
- Tỉ lệ chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi thử nghiệm.
- Khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể cơ quan phủ tạng. Nếu cần, làm vi thể xác định nguyên nhân.
- Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon. 2.2.1.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành trên chuột nhắt trắng [12],[45].
Chuột thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày, sau đó chia ngẫu chuột thành 3 lô, mỗi lô 30 con.
- Lô chứng: cho uống dung dịch NaCMC 1%. - Lô thử 1: uống TEC-01 với liều 100 mg/kg. - Lô thử 2: uống TEC-01 với liều 300 mg/kg.
TEC-01 được pha trong dung dịch NaCMC 1% để đảm bảo thể tích cho uống đồng đều ở tất cả các lô (0,2ml/10g chuột).
Chuột nhắt trắng được cho uống dung dịch NaCMC 1% hoặc TEC-01 hàng ngày vào khoảng 9 giờ sáng, liên tục trong 28 ngày. Tại 3 thời điểm: trước uống thuốc, sau 14 ngày và 28 ngày uống thuốc; giết chuột (mỗi thời điểm 10 con/lô) và lấy máu để đánh giá các chỉ tiêu:
- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua các chỉ số: số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu.
- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và chất chuyển hoá trong máu: AST, ALT, protein toàn phần, cholesterol.
- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng creatinin trong máu. Sau 28 ngày cho uống thuốc liên tục, giết ngẫu nhiên 30% số chuột trong mỗi lô, mổ chuột để quan sát đại thể và cấu trúc vi thể gan, thận.
2.2.2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm
2.2.2.1. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp
Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình gây phù thực nghiệm bằng carragenin [61].
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con. - Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống indomethacin với liều 10mg/kg. - Lô 3 (lô thử): uống TEC-01 với liều 60 mg/kg.
Chuột được uống thuốc trước khi gây viêm 1 giờ. Tiến hành gây viêm bằng cách tiêm 0.1 ml carragenin 1% vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột.
Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) vào các thời điểm: trước khi gây viêm, sau khi gây viêm 1 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ, 7 giờ, 24 giờ.
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.7. Sơ đồ đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình gây viêm bằng carragenin.
Mức độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức của Fontaine:
∆V (%) = (Vt – V0)/ V0× 100 Trong đó V0 : thể tích chân chuột trước khi gây viêm. Vt : thể tích chân chuột sau khi gây viêm. ∆V: độ tăng thể tích chân chuột.
2.2.2.2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn
Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của TEC-01 trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian [15],[16],[60].
Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 9 con. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gây viêm mạn bằng cách cấy viên amian (30±1mg/con chuột) đã được tiệt trùng (ở 1200C trong 2 giờ).
Sau khi cấy u hạt, cho chuột uống liên tục 7 ngày: - Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống prednisolon với liều 5mg/kg. - Lô 3 (lô thuốc thử): uống TEC-01 với liều 60mg/kg.
Ngày thứ 8 tiến hành giết chuột bằng ether, bóc tách u hạt, cân khối lượng ướt của u hạt rồi đem sấy ở 600C đến khối lượng không đổi (khoảng 18 giờ). Cân u hạt khô.
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.8. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt bằng amian.
I% = (Tc - Tt)/Tc × 100
Trong đó Tc: trọng lượng trung bình khối u hạt lô chứng trắng. Tt: trọng lượng trung bình khối u hạt lô thử.
I: tỷ lệ ức chế u hạt.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng giảm đau
2.2.3.1. Nghiên cứu tác dụng giảm đau quặn
Nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic [38].
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 con. - Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống aspirin với liều 240 mg/kg. - Lô 3 (lô thuốc thử): uống TEC-01 với liều 100 mg/kg.
Cho chuột uống thuốc, 30 phút sau tiêm màng bụng 0.1 ml acid acetic 1% cho mỗi chuột. Đếm số cơn đau quặn trong từng khoảng thời gian 5 phút một, kể từ ngay sau khi tiêm acid acetic và theo dõi liên tục trong vòng 30 phút. Biểu hiện của cơn đau quặn là cơ bụng co lại và chi sau duỗi thẳng.
Cách đánh giá kết quả: so sánh số cơn đau quặn đếm được ở lô uống TEC-01 so với các lô chứng tại cùng một khoảng thời gian để đánh giá tác dụng giảm đau của thuốc thử.
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.9. Sơ đồ quy trình thí nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình giảm đau quặn.
2.2.3.2. Nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình gây đau bằng phiến nóng
Đặt chuột nhắt trên tấm kim loại duy trì ở nhiệt độ 55±0.20C. Ghi lại thời gian chuột có phản ứng đầu tiên (nhảy lên hoặc liếm chân sau) bằng đồng hồ đếm giây, chọn những con có thời gian đáp ứng từ 8 đến 30 giây. Chia ngẫu nhiên số chuột được chọn thành 3 lô, mỗi lô 10 con.
- Lô 1 (lô chứng trắng): uống dung dịch NaCMC 1%. - Lô 2 (lô thử): uống TEC-01 với liều 100mg/kg.
- Lô 3: tiêm màng bụng dung dịch morphin với liều 6mg/kg.
Tiếp tục ghi lại thời gian phản ứng của chuột tại các thời điểm 1/2 giờ, 1 giờ, 2 giờ tính từ lúc cho chuột uống hoặc tiêm thuốc [60].
Sơ đồ nghiên cứu:
Hình 2.10. Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình giảm đau phiến nóng.
2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các giá trị được mô tả dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn), số liệu nghiên cứu được xử lý theo phương pháp one-way ANOVA trên phần mềm SPSS 17.0 để so sánh giá trị trung bình các lô.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CỦA TEC-01 3.1.1. Nghiên cứu độc tính cấp 3.1.1. Nghiên cứu độc tính cấp
- Kết quả thăm dò các mức liều thử cho thấy, sau 24 giờ uống thuốc ở mức liều 1000 mg TEC-01/kg chuột không gây chết chuột; với mức liều 3000 mg TEC-01/kg chuột gây chết 100% chuột. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dựa trên kết quả thăm dò thực nghiệm chính thức được bố trí như sau: chuột nhắt trắng 50 con, nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm 05 ngày được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con. Cho lần lượt từng lô chuột uống dung dịch TEC-01với mức liều từ 1000mg/kg chuột đến 3000mg/kg chuột. Pha TEC-01vào dung dịch MaCMC 1% để đảm bảo thể tích thuốc mỗi lần cho chuột uống là 0,2ml/10g chuột.
Bảng 3.1.Kết quả thử độc tính cấp của TEC-01 trên chuột nhắt trắng
Lô Liều dùng (mg/kg) Số chuột/lô (n) Số chuột chết trong vòng 72 giờ Tỉ lệ % chuột chết 1 1000 10 0 0 2 1500 10 4 40 3 2000 10 7 70 4 2500 10 8 80 5 3000 10 10 100
- Từ tỉ lệ % chuột chết của từng lô, tính LD50 theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon, kết quả như sau:
Nhận xét:
- Khoảng 1 - 2 giờ sau khi uống TEC-01: một số chuột có biểu hiện thở gấp, co giật và chết.
- Khoảng 24 - 48 giờ sau khi uống TEC-01: thêm một số chuột chết. - Sau 48 giờ: số chuột sống sót đều ăn uống hoạt động bình thường, không có biểu hiện ngộ độc.
3.1.2. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
3.1.2.1 Ảnh hưởng của TEC-01 tới tình trạng chung và thể trọng chuột Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống, hoạt động Trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột ở các lô đều ăn uống, hoạt động bình thường, phản xạ nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, phân khô, không thấy có biểu hiện bất thường.
Chuột nhắt trắng được cân ở ngày thứ 14 và 28 trong quá trình thực nghiệm. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của TEC-01 đến cân nặng của chuột
Thời điểm nghiên cứu Lô chứng n= 10 Lô thử 1 n= 10 Lô thử 2 n= 10 p (so với lô
chứng) N0 24,00 ±0,53 25,98 ±0,63 25,94 ±0,29 > 0,05 N14 26,40 ±0,52 ptr/s < 0,05 28,75 ±0,64 ptr/s < 0,05 28,38 ±0,51 ptr/s < 0,05 > 0,05 N28 27,96 ±0,79 ptr/s < 0,01 33,76 ±0,97 ptr/s < 0,01 31,24 ±0,68 ptr/s < 0,01 > 0,05 ptr/s: mức độ tin cậy so sánh giữa thời điểm sau khi uống thuốc và trước khi uống thuốc.
Nhận xét:
- Trong 4 tuần làm thực nghiệm, có sự tăng trưởng về cân nặng ở tất cả các lô chuột (ptr/s < 0,05).
- So sánh giữa các lô uống TEC-01 và lô chứng: không có sự khác biệt về sự tăng trưởng thể trọng giữa các lô tại tất cả các thời điểm nghiên cứu (p < 0,05).
3.1.2.2. Ảnh hưởng của TEC-01 tới các chỉ số huyết học
Để nghiên cứu ảnh hưởng của TEC-01 trên các chỉ số huyết học, chúng tôi đã xác định các thông số: số lượng hồng cầu (HC), số lượng bạch cầu (BC), số lượng tiểu cầu (PLT), lượng hemoglobin (Hb) và tỉ lệ hematocrit (HCT) tại thời điểm sau 14 ngày và sau 28 ngày uống thuốc liên tục.
Kết quả xét nghiệm số lượng HC, số lượng BC, số lượng tiểu cầu, lượng Hb và tỉ lệ HCT sau được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của TEC-01 trên các chỉ số huyết học
Chỉ số NC Thời điểm NC Lô chứng n = 10 Lô thử 1 n = 10 Lô thử 2 n = 10 p HC (1012/L) N14 8,16 ± 0,21 7,92 ± 0,33 6,87 ± 0,57 > 0,05 N28 7,99 ± 0,27 8,38 ± 0,22 8,51 ± 0,21 > 0,05 Hb (g/100ml) N14 13,35 ± 0,36 12,14 ± 0,49 11,34 ± 1,00 > 0,05 N28 13,34 ± 0,31 12,56 ± 0,43 13,17 ± 0,39 > 0,05 HCT (%) N14 37,59 ± 1,11 35,57 ± 1,49 32,72 ± 2,16 > 0,05 N28 37,89 ± 1,29 37,20 ± 1,13 38,28 ± 0,88 > 0,05 PLT N14 716,56 ± 31,88 721,00 ± 40,46 694,60 ± 47,05 > 0,05 N28 812,20 ± 38,41 792,90 ± 35,59 793,78 ± 33,35 > 0,05 BC (109/L) N14 1,95 ± 0,20 1,80 ± 0,15 1,64 ± 0,21 > 0,05 N28 1,58 ± 0,19 1,99 ± 0,22 1,48 ± 0,11 > 0,05
Nhận xét:
- Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: sau 2 tuần và 4 tuần chuột được uống thuốc liên tục, tất cả các chỉ số huyết học (số lượng HC, số lượng BC, số lượng tiểu cầu, lượng Hb và tỉ lệ HCT) ở cả lô thử 1 và lô thử 2 đều không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng (p>0,05).
3.1.2.3. Ảnh hưởng của TEC-01 tới chức năng gan
Ảnh hưởng của TEC-01 trên chức năng gan được đánh giá qua các thông số AST, ALT, cholesterol toàn phần, protein toàn phần ở các thời điểm sau 14 ngày uống thuốc liên tục (N14), sau 28 ngày uống thuốc liên tục (N28). Kết quả nghiên cứu (NC) được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của TEC-01 đến chức năng gan
Chỉ số NC điểm Thời NC Lô chứng n= 10 Lô thử 1 n= 10 Lô thử 2 n= 10 p SGOT (U/L) N14 176,28 ± 9,38 156,75 ± 7,11 155,13 ± 7,54 > 0,05 N28 194,58 ± 17,27 173,91 ± 18,611 209,41 ± 22,02 > 0,05 SGPT (U/L) N14 59,68 ± 4,79 64,74 ± 3,15 64,80 ± 5,93 > 0,05 N28 75,04 ± 3,99 82,66 ± 5,48 74,09 ± 7,90 > 0,05 Cholesterol toàn phần (mmol/L) N14 1,88 ± 0,10 2,06 ± 0,11 2,05 ± 0,12 > 0,05 N28 2,04 ± 0,14 1,79 ± 0,13 1,76 ± 0,10 > 0,05 Protein toàn phần (g/dL) N14 46,29 ± 0,98 46,13 ± 0,96 47,36 ± 1,11 > 0,05 N28 43,89 ± 2,27 44,98 ± 1,54 44,49 ± 2,61 > 0,05 Nhận xét:
- Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy: sau 2 tuần và 4 tuần chuột được uống thuốc liên tục, tất cả các xét nghiệm đánh giá chức năng gan (AST, ALT,
cholesterol toàn phần, protein toàn phần) ở cả lô thử 1 và lô thử 2 đều không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng (p > 0.05).
3.1.2.4. Ảnh hưởng của TEC-01 tới chức năng thận (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh hưởng của TEC-01 trên chức năng thận được đánh giá thông qua chỉ số creatinin huyết thanh của chuột thực nghiệm ở các thời điểm sau 14 ngày uống thuốc liên tục (N14), sau 28 ngày uống thuốc liên tục (N28). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của TEC-01 đến chức năng thận
Chỉ số NC Thời điểm NC Lô chứng n= 10 Lô thử 1 n= 10 Lô thử 2 n= 10 p Creatinin (μmol/L) N14 399,94 ± 10,26 368,26 ± 15,41 354,65 ± 29,44 > 0,05 N28 417,54 ± 12,38 419,83 ± 5,46 431,98 ± 7,45 > 0,05 Nhận xét:
- Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy: sau 2 tuần và 4 tuần chuột được uống thuốc liên tục, hàm lượng creatinin trong máu chuột đều không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng (p > 0,05).
3.1.2.5. Mô bệnh học
Sau khi cho chuột uống TEC-01 liên tục trong 4 tuần chọn ngẫu nhiên 30% số chuột (mỗi lô 3 con) mổ để kiểm tra cấu trúc đại thể của các cơ quan và cấu trúc vi thể gan, thận chuột. Kết quả như sau:
* Đại thể các cơ quan
Không quan sát thấy có sự thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể của các cơ quan tim, phổi, gan, thận và hệ tiêu hóa trên chuột ở cả 3 lô.
* Hình thái vi thể gan, thận
Ảnh 3.1. Hình ảnh vi thể gan lô chứng (HE x 400) Ảnh 3.4. Hình ảnh vi thể thận lô chứng (HE x 400) Ảnh 3.2. Hình ảnh vi thể gan lô thử 1 (HE x 400) Ảnh 3.5. Hình ảnh vi thể thận lô thử 1 (HE x 400) Ảnh 3.3. Hình ảnh vi thể gan lô thử 2 (HE x 400) Ảnh 3.6. Hình ảnh vi thể thận lô thử 2 (HE x 400)
Hình 3.11 Ảnh hưởng của TEC-01 đến cấu trúc vi thể gan, thận chuột nhắt trắng sau 28 ngày uống thuốc liên tục.
Nhận xét:
Hình 3.11 cho thấy:
Ở cả lô chứng và lô uống TEC-01, hình ảnh cấu trúc vi thể của các tế bào gan bình thường. Tuy nhiên, có thấy một vài hình ảnh viêm nhẹ như khoảng cửa viêm nhẹ, xung huyết tĩnh mạch trung tâm ở tất cả các lô.
Hình ảnh cấu trúc vi thể thận chuột trong giới hạn bình thường, chưa quan sát thấy các tổn thương ở cả lô chứng và ở 2 lô uống TEC-01 với liều 100 mg/kg và 300 mg/kg.
3.2. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA TEC-01
3.2.1. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin phù chân chuột bằng carragenin
Thí nghiệm đã được tiến hành trên 3 lô chuột cống trắng, mỗi lô 8 con: - Lô 1 (lô chứng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống indomethacin với liều 10 mg/kg. - Lô 3 (lô thử): uống TEC-01 với liều 60 mg/kg.
Mức độ tăng thể tích chân chuột tại các thời điểm 1giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5