4.1.1. Độc tính cấp
Chúng tôi đã tiến hành thử độc tính của TEC-01 theo hướng dẫn của OECD về thử độc tính. Độc tính cấp của TEC-01 được thử trên chuột nhắt trắng.
Trong thực nghiệm, chúng tôi đã cho chuột nhắt trắng uống TEC-01 với liều tăng dần từ mức liều từ cao nhất không gây chết là 1,0g TEC-01/kg tới mức liều thấp nhất gây chết là 3,0g TEC-01/kg thể trọng. Một số chuột chết sau khi uống thuốc thử 1-2 giờ, một số chuột chết sau 24-48 giờ; số chuột sống sót còn lại hoạt động bình thường, không có biểu hiện ngộ độc.
Từ tỉ lệ chuột chết (theo bảng 3.1), chúng tôi tính được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống là 1,735 (1,449-1,990) g/kg chuột. Nếu áp dụng bảng phân loại độc GSH (Globally harmonised classification system for chemical subtances) của OECD thì mức liều này cho thấy tectorigenin nằm
trong mức độc tính trung bình, gần sát với mức có độc tính thấp.
Qua tham khảo các tài liệu, mức liều tectorigenin thường được sử dụng để đánh giá các tác dụng sinh học là khoảng 100mg/kg. So sánh mức liều này với LD50 (LD50 gấp khoảng 17 lần mức liều có tác dụng sinh học) cho thấy tectorigenin có phạm vi an toàn rộng. Do đó, chúng tôi dự kiến mức liều để đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau của TEC-01 được sử dụng trong các thử nghiệm trên chuột nhắt trắng là 100mg/kg/ngày; trên chuột cống trắng là 60mg/kg/ngày (tính theo hệ số 0,55 trên chuột nhắt) [33],[40],[41],[48],[55].
4.1.2. Độc tính bán trường diễn
Để có thể tiến hành thử nghiệm thuốc hay một chế phẩm mới trên người, nhất thiết phải có các nghiên cứu đánh giá độc tính và tác dụng dược lý trước đó trên động vật thực nghiệm. Đánh giá độc tính bao gồm nghiên cứu độc tính cấp (acute toxiciy study) và nghiên cứu độc tính dài hạn (long-term toxiciy study). Nghiên cứu độc tính bán trường diễn hay một loại nghiên cứu độc tính dài hạn được thực hiện bằng cách cho động vật thí nghiệm uống thuốc thử hàng ngày liên tục trong một khoản thời gian nhất định.
Độc tính bán trường diễn có thể được thử trên các loài gặm nhấm hoặc không gặm nhấm. Động vật không gặm nhấm có thể là chó hoặc khỉ, động vật gặm nhấm là chuột cống hoặc thỏ [12]. Có thể tiến hành thử trên chuột nhắt nhưng không khuyến khích vì động vật quá nhỏ, tuy nhiên do lượng TEC-01 chiết tách được từ xạ can tương đối ít nên không đủ để tiến hành thử độc tính bán trường diễn trên thỏ, vì vậy chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trên chuột nhắt trắng.
Chúng tôi tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn của TEC-01 trên chuột nhắt trắng với mức liều 100mg/kg cân nặng/ngày (mức liều dự kiến có tác dụng dược lý) và mức liều 300mg/kg cân nặng/ngày (gấp 3 lần mức liều dự kiến có tác dụng dược lý). Chuột được uống TEC-01 liên tục 28 ngày; ở
các thời điểm trước khi uống thuốc, ngày thứ 14 và ngày thứ 28, chuột được lấy máu để định lượng các chỉ số huyết học, các chỉ số sinh hóa để đánh giá chức năng gan và thận. Sau 28 ngày uống thuốc liên tục, mổ ngẫu nhiên 30% số chuột ở mỗi lô để quan sát đại thể và vi thể gan, thận.
4.1.2.1. Tình trạng chung, cân nặng của chuột
Tình trạng chung và sự thay đổi cân nặng phản ánh bộ mặt chung của cơ thể và là những chỉ số bắt buộc phải được đánh giá trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn. Trong suốt thời gian nghiên cứu, tất cả chuột ở lô uống TEC- 01 và lô uống dung môi đều khoẻ mạnh, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống, hoạt động, bài tiết bình thường. Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: cân nặng của chuột ở cả hai lô thử và lô chứng đều không giảm mà có xu hướng tăng lên nhưng không có sự khác biệt giữa các lô với nhau (p > 0,05).
Như vậy, với mức liều 100mg/kg và 300mg/kg cân nặng, TEC-01 chưa thể hiện sự ảnh hưởng đến tình trạng chung và cân nặng của chuột.
4.1.2.2. Ảnh hưởng của TEC-01 đến các chỉ số huyết học
Máu là tổ chức rất quan trọng trong cơ thể, liên quan mật thiết với mọi bộ phận trong cơ thể. Về mặt bệnh lý, máu chịu ảnh hưởng của một số cơ quan trong cơ thể, nhưng đồng thời cũng phản ánh tình trạng riêng của cơ quan tạo máu. Nếu thuốc ảnh hưởng đến cơ quan tạo máu thì trước hết các thành phần của máu sẽ bị thay đổi. Do đó, để nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đến chức phận tạo máu, các chỉ số về số lượng hồng cầu, số lượng huyết sắc tố, hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu của chuột thí nghiệm được xác định [11] ,[17].
Huyết sắc tố trong hồng cầu giữ vai trò quan trọng, tiếp nhận oxy từ phổi đưa đến các cơ quan trong cơ thể và lấy CO2 ra khỏi cơ thể. Định lượng huyết sắc tố sẽ biết được chức năng của hồng cầu.
tích trung bình hồng cầu phản ánh được đặc điểm của tình trạng thiếu máu trong cơ thể. Nếu thuốc làm giảm số lượng hồng cầu, lượng huyết sắc tố hoặc hematocrit sẽ gây tình trạng thiếu máu.
Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi gián tiếp phản ánh chức năng bảo vệ cơ thể, đồng thời cũng phản ánh chức phận của cơ quan tạo máu.
Tiểu cầu có nhiệm vụ chính là tham gia vào cơ chế cầm máu, đông máu. Theo dõi 5 chỉ số đánh giá chức phận tạo máu của chuột (số lượng hồng cầu, số lượng huyết sắc tố, hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu), kết quả ở bảng 3.3 cho thấy sau 14 ngày và 28 ngày uống TEC-01, tất cả các chỉ số trên ở cả hai lô uống thuốc thử đều ở trong giới hạn bình thường, không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng ( p > 0,05).
Tóm lại, chưa quan sát thấy ảnh hưởng của TEC-01 đến các chỉ số huyết học của chuột.
4.1.2.3.Ảnh hưởng của TEC-01 lên chức năng gan
Trong cơ thể, gan có vai trò rất lớn, đảm nhiệm nhiều chức năng quan trọng và phức tạp. Khi đưa thuốc vào cơ thể, thuốc có thể gây độc với gan, làm ảnh hưởng tới chức năng gan. Vì vậy khi đánh giá độc tính của thuốc, luôn cần nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc tới chức năng gan.
Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ các enzym có nguồn gốc tại gan trong huyết thanh. Khi nồng độ các enzym này tăng thường gắn liền với độc tính của thuốc do sự huỷ hoại tế bào gan. Như đã biết, ALT là enzym có nhiều nhất ở gan, chỉ khư trú trong bào tương của tế bào gan. Khác với ALT, AST không những có ở gan mà còn có ở các cơ quan khác. Trong tế bào gan, AST chủ yếu khư trú ở trong ty thể, chỉ một phần khư trú ở bào tương. Khi có tổn thương huỷ hoại màng tế bào gan, thậm chí chỉ thay đổi tính thấm của màng tế bào thì hoạt độ ALT đã tăng cao. Khi tổn thương tế bào gan nặng hơn, ở mức dưới tế bào, AST trong ty thể mới
được giải phóng ra ngoài. Do vậy trong tổn thương gan, hoạt độ ALT trong máu luôn tăng cao hơn AST và đặc hiệu hơn trong các bệnh lý về gan [6],[25].
Trong nghiên cứu này, hoạt độ AST và ALT trong máu chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa lô uống thuốc thử so với lô chứng sau khi uống thuốc liên tục 14 ngày và 28 ngày (Bảng 3.4), chứng tỏ TEC-01 không gây tổn thương các tế bào gan.
Gan là cơ quan chính tạo ra albumin, một số globulin và các yếu tố đông máu. Nguyên nhân chính gây thay đổi protid huyết thanh, đặc biệt albumin thường do tổn thương tế bào gan. Định lượng protein toàn phần trong máu có vai trò chẩn đoán và tiên lượng bệnh gan.
Mặt khác gan còn tham gia vào quá trình tổng hợp và chuyển hoá lipid. Cholesterol là một trong những thành phần chính của mật, được gan tổng hợp, este hóa và thải trừ ra ngoài. Định lượng cholesterol trong máu để đánh giá chức năng chuyển hóa lipid của gan [17].
Trong nghiên cứu này, hàm lượng protein toàn phần và cholesterol trong máu chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa lô thử so với lô chứng sau khi uống thuốc liên tục 14 ngày và 28 ngày (bảng 3.4), chứng tỏ TEC-01 không ảnh hưởng tới chức năng tổng hợp protid và lipid của gan.
Kết quả quan sát mô bệnh học của gan cho thấy: sau 28 ngày uống TEC- 01 liên tục, quan sát đại thể gan ở hai lô uống thuốc đều không thấy hình ảnh tổn thương. Trên hình ảnh vi thể, phần lớn các tế bào gan bình thường. Tuy nhiên, có thấy một vài hình ảnh sung huyết tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa viêm nhẹ ở cả lô chứng và 2 lô uống TEC-01 (hình 3.11).
Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy TEC-01 chưa thể hiện sự ảnh hưởng đến các chỉ số sinh hóa đánh giá chức năng gan và cấu trúc gan. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1.2.4. Ảnh hưởng của TEC-01 đến chức năng thận
Thận là cơ quan bài tiết của cơ thể. Cầu thận và ống thận rất dễ bị tổn thương bởi các chất nội sinh và ngoại sinh, trong đó có thuốc. Thận có đặc điểm dễ bị ngộ độc hơn các mô khác vì là mô có nhiều máu qua nhất. Khi đưa thuốc vào cơ thể, phần lớn các thuốc được đào thải ra ngoài qua thận, nhiều thuốc có thể gây độc cho thận, từ đó ảnh hưởng tới chức năng thận.
Creatinin là một xét nghiệm dùng để đánh giá chức năng lọc của cầu thận. Creatinin là thành phần đạm ở trong máu ổn định nhất, không phụ thuộc vào chế độ ăn, những thay đổi sinh lý mà chỉ phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận. Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ creatinin tăng sớm hơn ure. Do vậy để đánh giá và theo dõi chức năng thận, creatinin máu là chỉ tiêu quan trọng và tin cậy hơn ure [17],[6].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, so sánh hàm lượng creatinin trong máu chuột ở chứng và các lô uống thuốc thử (uống TEC-01 liều 100mg /kg và 300mg /kg) ở thời điểm trước và sau dùng thuốc 14 ngày và 28 ngày không thấy sự thay đổi có ý nghĩa (bảng 3.5).
Quan sát đại thể thận của các lô chuột nghiên cứu đều chưa thấy có biểu hiện bất thường. Cấu trúc vi thể của 30% số chuột thực nghiệm sau uống TEC-01 liên tục 28 ngày vẫn nằm trong giới hạn bình thường, chưa thấy có hình ảnh tổn thương (hình 3.11).
Cho đến nay, trên thế giới và ở Việt Nam chúng tôi chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào về độc tính bán trường diễn của tectorigenin. Trong “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” của Viện Dược Liệu (2004) chỉ nhắc đến độc tính thấp của dịch chiết xạ can mà không đề cập đến độc tính của tectorigenin. Vì vậy chúng tôi không có tài liệu để so sánh.
Kết quả nghiên cứu cho thấy TEC-01 chưa thể hiện sự ảnh hưởng đến tình trạng chung của chuột, các chỉ số về sự gia tăng khối lượng cơ thể, các
chỉ số huyết học, chức năng gan và thận của chuột cũng như mô bệnh học của một số cơ quan.
Thông thường, một hoạt chất có biểu hiện độc tính cấp thì rất có thể sẽ biểu hiện độc tính bán trường diễn. Tuy nhiên, qua kết quả nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bàn trường diễn chúng tôi thu được, TEC-01 đã không tuân theo quy luật đó. Độc tính cấp của TEC-01 sát với mức độc thấp nhưng thuốc không thể hiện độc tính trên thử nghiệm dài ngày. Điều này có thể một phần do ảnh hưởng của động vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng - loại động vật đáp ứng sinh học kém nhất trong các loại động vật thử nghiệm như thỏ, chó.... Do đó, để đánh giá được đầy đủ và chính xác hơn về độc tính bán trường diễn của TEC-01, chúng tôi kiến nghị tiến hành thử nghiệm thêm trên các loài động vật khác, theo nhiều đường dùng thuốc khác nhau.
4.2. BÀN LUẬN VỀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA TEC-01
Trong các nhóm hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có tác dụng chống viêm, flavonoid nổi bật lên là nhóm có tác dụng chống viêm mạnh, cả tác dụng chống viêm cấp và chống viêm mạn. Tectorigenin là một flavonoid và là thành phần chính có hoạt tính trong xạ can - vị thuốc cũng được sử dụng chủ yếu để chữa nhiều bệnh liên quan đến viêm như viêm họng cấp và mạn, viêm amidan...[24]. Thêm vào đó, trên thế giới tectorigenin đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm in vitro [35],[46]. Từ những cơ sở trên, chúng tôi đã lựa chọn tìm hiểu tác dụng sinh học đầu tiên của TEC-01 là tác dụng chống viêm. Chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng chống viêm của TEC-01 trên cả mô hình gây viêm cấp (gây phù bàn chân chuột bằng carragenin) và mô hình gây viêm mạn (gây u hạt thực nghiệm bằng amian).
4.2.1. Về tác dụng chống viêm của TEC-01 trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin
Chúng tôi lựa chọn mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin để đánh giá tác dụng chống viêm cấp. So với các mô hình chống viêm cấp và bán cấp khác thì mô hình gây phù chân chuột là đơn giản, dễ dàng thực hiện hơn, và phù hợp cho cả mục đích sàng lọc lẫn nghiên cứu sâu. Đây cũng là mô hình được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam để đánh giá tác dụng chống viêm.
Chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm cấp của TEC-01 ở mức liều là 60 mg/kg cho chuột cống trắng (tương đương liều chuột nhắt trắng 100mg/kg).
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.6 cho thấy: sau khi gây viêm bằng caragenin, mức độ phù chân chuột ở lô uống TEC-01 tại thời diểm 5 giờ (19,70 ± 6,62) và 7 giờ (20,40 ± 6,32) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (5 giờ: 46,93 ± 5,86; 7 giờ: 62,41 ± 6,64); p<0,05. Tác dụng chống viêm này không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô uống indomethacin liều 10 mg/kg (5 giờ: 25,34 ± 3,17; 7 giờ: 34,72 ± 4,36); p>0,05.
Trong, mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin, quá trình viêm diễn ra theo hai pha. Pha đầu tiên bắt đầu ngay sau khi tiêm và giảm xuống nhanh trong vòng 1 giờ đầu. Pha này giải phóng ra histamin và serotonin. Pha thứ hai bắt đầu sau khi kết thúc pha một và giải phóng ra các PG, protease và lysosom. Hầu hết các thuốc có tác dụng chống viêm đều có tác dụng trên pha hai [28],[59]. TEC-01 cũng thể hiện tác dụng chống viêm trên pha hai: thuốc tác dụng tốt nhất ở khoảng 5-7 giờ sau khi gây viêm. So sánh với tectorigenin, nhiều flavonoid cũng có đáp ứng tương tự với mô hình này như: queretin ở liều 75mg/kg, hesperidin liều 80mg/kg, kaemferol glycosid...[54].
Như vậy, TEC-01 liều 60mg/kg có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin ở thời điểm 5-7 giờ, tác dụng này tương đương với indomethacin liều 10mg/kg.
4.2.2. Tác dụng chống viêm mạn của TEC-01 trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian
Khi đưa vào cơ thể các tác nhân gây viêm trơ như bông, amian, chất dẻo… không có khả năng tiêu đi bởi quá trình viêm thì cơ thể phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào xung quanh dị vật và tạo thành u hạt. Về tổ chức học, u hạt là nơi tập trung nhiều loại tế bào như bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu hạt ưa base, tế bào dạng biểu mô, nguyên bào sợi… Khi u hạt hình thành, quá trình viêm đã đi vào giai đoạn mạn tính mà đặc trưng là có sự tham gia tích cực của các loại tế bào. Các thuốc có khả năng ức chế sự phát triển của u hạt được xem như có tác dụng chống viêm mạn trên động vật thực nghiệm.
Dựa vào các nghiên cứu trước đó của Đỗ Trung Đàm và một số nghiên cứu khác, chúng tôi đã lựa chọn mô hình gây hình u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng để nghiên cứu chống viêm mạn của TEC-01 [15],[16]. Việc