quặn bằng acid acetic
Thí nghiệm đã được tiến hành trên 3 lô chuột nhắt trắng, mỗi lô 10 con: - Lô 1 (lô chứng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô chứng dương): uống aspirin với liều 240 mg/kg. - Lô 3 (lô thuốc thử): uống TEC-01 với liều 100 mg/kg.
Số cơn đau quặn của các lô chuột trong các giai đoạn từ 0 - 30 phút sau khi gây đau bằng acid acetic như sau:
Hình 3.13. Số cơn đau quặn qua các giai đoạn của các lô chuột Bảng 3.8. Số cơn đau quặn trong các giai đoạn sau khi gây đau bằng
acid acetic ở các lô nghiên cứu.
Thời gian (phút)
Số cơn đau quặn
0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 Lô 1 (n=10) 10,00 ± 0,61 18,00 ± 0,47 18,10±0,39 13,77±0,35 14,00± 0,28 11,3± 0,32 Lô 2 (n=10) 5,25± 0,54 11,00 ± 0,43 9,75±0,45 7,50 ± 0,22 7,25±0,26 6,87±0,24 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 p2/1 < 0,05 Lô 3 (n=10) 5,57 ± 0,49 11,1 ± 0,33 7,14 ± 0,54 8,4 ± 0,33 7,14± 0,40 6,0 ± 0,28 p3/2 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/2 > 0,05 p3/1 < 0,05 p3/2 > 0,05
Nhận xét:
Từ hình 3.13 và bảng 3.8 cho thấy:
- So sánh giữa lô uống TEC-01 với lô chứng : sau 5 phút số cơn đau quặn giữa các lô uống TEC-01 và lô chứng trắng khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
- So sánh giữa lô uống TEC-01 với lô chứng dương: số cơn đau quặn giữa lô thuốc thử và lô chứng dương là không khác nhau (p > 0,05).
3.3.2. Nghiên cứu tác dụng giảm đau của TEC-01 trên mô hình gây đau bằng phiến nóng
Thí nghiệm đã được tiến hành trên 3 lô chuột, mỗi lô 10 con: - Lô 1 (lô chứng): uống dung dịch NaCMC 1%.
- Lô 2 (lô thử): uống TEC-01 với liều 100 mg/kg.
- Lô 3 : tiêm màng bụng dung dịch morphin với liều 6mg/kg.
Thời gian đáp ứng với kích thích gây đau của các lô chuột tại thời điểm trước và sau khi uống thuốc 1/2 giờ, 1 giờ, 2 giờ thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.14.
Bảng 3.9.Thời gian đáp ứng đau của các lô chuột
Lô
Thời gian đáp ứng đau
0 giờ 1/2 giờ 1 giờ 2 giờ
Lô 1 (n = 10) 15,91±0,81 14,82±1,61 18,18±2,60 18,45±2,25 Lô 2 (n=10) 15,00±1,24 p2/1 > 0,05 17,89±1,62 p2/1 > 0,05 20,67±4,70 p2/1 > 0,05 17,22±5,11 p2/1 > 0,05 Lô 3 (n=10) 15,44±1,97 p3/1 > 0,05 101,22±27,92 p3/1 < 0,05 34,78±7,09 p3/1 < 0,05 39,44±6,75 p3/1 < 0,05 Ghi chú: px/y: mức độ tin cậy của lô x so với lô y (x,y: 1,2,3)
Hình 3.14.Thời gian đáp ứng đau của các lô chuột Nhận xét:
Từ bảng 3.9 và hình 3.14 cho thấy:
- Thời gian đáp ứng đau của lô uống TEC-01so với lô chứng trắng không khác nhau (p > 0,05).
- Thời gian đáp ứng đau của lô morphin so với lô chứng trắng và so với lô uống TEC-01 là khác nhau (p < 0,05).
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
Xạ can là một thảo dược mọc hoang ở nhiều nơi. Bên cạnh đó cây còn được trồng làm cảnh ở nhiều vùng trên khắp cả nước. Xạ can rất dễ trồng, cây sống dai và dễ thu hoạch. Từ xa xưa, nhân dân ta đã biết sử dụng xạ can để chữa nhiều bệnh như: viêm họng, viêm amidan… Thành phần có tác dụng chính trong cây xạ can là các flavonoid, đặc biệt trong đó xạ can chứa hàm lượng cao tectorigenin [24]. Các hoạt tính sinh học của tectorigenin đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và công bố. Chính vì vậy, với TEC-01 (95% tectorigenin) do Viện hóa học các hợp chất tự nhiên cung cấp, chúng tôi đã tiến hành đề tài này nhằm mục đích đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của tectorigenin chiết xuất từ xạ can Việt Nam. Kết quả thu được sẽ góp phần mở ra triển vọng đưa tectorigenin - với nguồn cung dược liệu dồi dào từng bước trở thành một hoạt chất được ứng dụng trên lâm sàng.
4.1. BÀN LUẬN VỀ ĐỘC TÍNH 4.1.1. Độc tính cấp 4.1.1. Độc tính cấp
Chúng tôi đã tiến hành thử độc tính của TEC-01 theo hướng dẫn của OECD về thử độc tính. Độc tính cấp của TEC-01 được thử trên chuột nhắt trắng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong thực nghiệm, chúng tôi đã cho chuột nhắt trắng uống TEC-01 với liều tăng dần từ mức liều từ cao nhất không gây chết là 1,0g TEC-01/kg tới mức liều thấp nhất gây chết là 3,0g TEC-01/kg thể trọng. Một số chuột chết sau khi uống thuốc thử 1-2 giờ, một số chuột chết sau 24-48 giờ; số chuột sống sót còn lại hoạt động bình thường, không có biểu hiện ngộ độc.
Từ tỉ lệ chuột chết (theo bảng 3.1), chúng tôi tính được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống là 1,735 (1,449-1,990) g/kg chuột. Nếu áp dụng bảng phân loại độc GSH (Globally harmonised classification system for chemical subtances) của OECD thì mức liều này cho thấy tectorigenin nằm
trong mức độc tính trung bình, gần sát với mức có độc tính thấp.
Qua tham khảo các tài liệu, mức liều tectorigenin thường được sử dụng để đánh giá các tác dụng sinh học là khoảng 100mg/kg. So sánh mức liều này với LD50 (LD50 gấp khoảng 17 lần mức liều có tác dụng sinh học) cho thấy tectorigenin có phạm vi an toàn rộng. Do đó, chúng tôi dự kiến mức liều để đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau của TEC-01 được sử dụng trong các thử nghiệm trên chuột nhắt trắng là 100mg/kg/ngày; trên chuột cống trắng là 60mg/kg/ngày (tính theo hệ số 0,55 trên chuột nhắt) [33],[40],[41],[48],[55].
4.1.2. Độc tính bán trường diễn
Để có thể tiến hành thử nghiệm thuốc hay một chế phẩm mới trên người, nhất thiết phải có các nghiên cứu đánh giá độc tính và tác dụng dược lý trước đó trên động vật thực nghiệm. Đánh giá độc tính bao gồm nghiên cứu độc tính cấp (acute toxiciy study) và nghiên cứu độc tính dài hạn (long-term toxiciy study). Nghiên cứu độc tính bán trường diễn hay một loại nghiên cứu độc tính dài hạn được thực hiện bằng cách cho động vật thí nghiệm uống thuốc thử hàng ngày liên tục trong một khoản thời gian nhất định.
Độc tính bán trường diễn có thể được thử trên các loài gặm nhấm hoặc không gặm nhấm. Động vật không gặm nhấm có thể là chó hoặc khỉ, động vật gặm nhấm là chuột cống hoặc thỏ [12]. Có thể tiến hành thử trên chuột nhắt nhưng không khuyến khích vì động vật quá nhỏ, tuy nhiên do lượng TEC-01 chiết tách được từ xạ can tương đối ít nên không đủ để tiến hành thử độc tính bán trường diễn trên thỏ, vì vậy chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trên chuột nhắt trắng.
Chúng tôi tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn của TEC-01 trên chuột nhắt trắng với mức liều 100mg/kg cân nặng/ngày (mức liều dự kiến có tác dụng dược lý) và mức liều 300mg/kg cân nặng/ngày (gấp 3 lần mức liều dự kiến có tác dụng dược lý). Chuột được uống TEC-01 liên tục 28 ngày; ở
các thời điểm trước khi uống thuốc, ngày thứ 14 và ngày thứ 28, chuột được lấy máu để định lượng các chỉ số huyết học, các chỉ số sinh hóa để đánh giá chức năng gan và thận. Sau 28 ngày uống thuốc liên tục, mổ ngẫu nhiên 30% số chuột ở mỗi lô để quan sát đại thể và vi thể gan, thận.
4.1.2.1. Tình trạng chung, cân nặng của chuột
Tình trạng chung và sự thay đổi cân nặng phản ánh bộ mặt chung của cơ thể và là những chỉ số bắt buộc phải được đánh giá trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn. Trong suốt thời gian nghiên cứu, tất cả chuột ở lô uống TEC- 01 và lô uống dung môi đều khoẻ mạnh, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống, hoạt động, bài tiết bình thường. Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: cân nặng của chuột ở cả hai lô thử và lô chứng đều không giảm mà có xu hướng tăng lên nhưng không có sự khác biệt giữa các lô với nhau (p > 0,05).
Như vậy, với mức liều 100mg/kg và 300mg/kg cân nặng, TEC-01 chưa thể hiện sự ảnh hưởng đến tình trạng chung và cân nặng của chuột.
4.1.2.2. Ảnh hưởng của TEC-01 đến các chỉ số huyết học
Máu là tổ chức rất quan trọng trong cơ thể, liên quan mật thiết với mọi bộ phận trong cơ thể. Về mặt bệnh lý, máu chịu ảnh hưởng của một số cơ quan trong cơ thể, nhưng đồng thời cũng phản ánh tình trạng riêng của cơ quan tạo máu. Nếu thuốc ảnh hưởng đến cơ quan tạo máu thì trước hết các thành phần của máu sẽ bị thay đổi. Do đó, để nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đến chức phận tạo máu, các chỉ số về số lượng hồng cầu, số lượng huyết sắc tố, hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu của chuột thí nghiệm được xác định [11] ,[17].
Huyết sắc tố trong hồng cầu giữ vai trò quan trọng, tiếp nhận oxy từ phổi đưa đến các cơ quan trong cơ thể và lấy CO2 ra khỏi cơ thể. Định lượng huyết sắc tố sẽ biết được chức năng của hồng cầu.
tích trung bình hồng cầu phản ánh được đặc điểm của tình trạng thiếu máu trong cơ thể. Nếu thuốc làm giảm số lượng hồng cầu, lượng huyết sắc tố hoặc hematocrit sẽ gây tình trạng thiếu máu.
Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi gián tiếp phản ánh chức năng bảo vệ cơ thể, đồng thời cũng phản ánh chức phận của cơ quan tạo máu.
Tiểu cầu có nhiệm vụ chính là tham gia vào cơ chế cầm máu, đông máu. Theo dõi 5 chỉ số đánh giá chức phận tạo máu của chuột (số lượng hồng cầu, số lượng huyết sắc tố, hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu), kết quả ở bảng 3.3 cho thấy sau 14 ngày và 28 ngày uống TEC-01, tất cả các chỉ số trên ở cả hai lô uống thuốc thử đều ở trong giới hạn bình thường, không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng ( p > 0,05).
Tóm lại, chưa quan sát thấy ảnh hưởng của TEC-01 đến các chỉ số huyết học của chuột.
4.1.2.3.Ảnh hưởng của TEC-01 lên chức năng gan
Trong cơ thể, gan có vai trò rất lớn, đảm nhiệm nhiều chức năng quan trọng và phức tạp. Khi đưa thuốc vào cơ thể, thuốc có thể gây độc với gan, làm ảnh hưởng tới chức năng gan. Vì vậy khi đánh giá độc tính của thuốc, luôn cần nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc tới chức năng gan.
Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ các enzym có nguồn gốc tại gan trong huyết thanh. Khi nồng độ các enzym này tăng thường gắn liền với độc tính của thuốc do sự huỷ hoại tế bào gan. Như đã biết, ALT là enzym có nhiều nhất ở gan, chỉ khư trú trong bào tương của tế bào gan. Khác với ALT, AST không những có ở gan mà còn có ở các cơ quan khác. Trong tế bào gan, AST chủ yếu khư trú ở trong ty thể, chỉ một phần khư trú ở bào tương. Khi có tổn thương huỷ hoại màng tế bào gan, thậm chí chỉ thay đổi tính thấm của màng tế bào thì hoạt độ ALT đã tăng cao. Khi tổn thương tế bào gan nặng hơn, ở mức dưới tế bào, AST trong ty thể mới
được giải phóng ra ngoài. Do vậy trong tổn thương gan, hoạt độ ALT trong máu luôn tăng cao hơn AST và đặc hiệu hơn trong các bệnh lý về gan [6],[25].
Trong nghiên cứu này, hoạt độ AST và ALT trong máu chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa lô uống thuốc thử so với lô chứng sau khi uống thuốc liên tục 14 ngày và 28 ngày (Bảng 3.4), chứng tỏ TEC-01 không gây tổn thương các tế bào gan.
Gan là cơ quan chính tạo ra albumin, một số globulin và các yếu tố đông máu. Nguyên nhân chính gây thay đổi protid huyết thanh, đặc biệt albumin thường do tổn thương tế bào gan. Định lượng protein toàn phần trong máu có vai trò chẩn đoán và tiên lượng bệnh gan.
Mặt khác gan còn tham gia vào quá trình tổng hợp và chuyển hoá lipid. Cholesterol là một trong những thành phần chính của mật, được gan tổng hợp, este hóa và thải trừ ra ngoài. Định lượng cholesterol trong máu để đánh giá chức năng chuyển hóa lipid của gan [17].
Trong nghiên cứu này, hàm lượng protein toàn phần và cholesterol trong máu chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa lô thử so với lô chứng sau khi uống thuốc liên tục 14 ngày và 28 ngày (bảng 3.4), chứng tỏ TEC-01 không ảnh hưởng tới chức năng tổng hợp protid và lipid của gan.
Kết quả quan sát mô bệnh học của gan cho thấy: sau 28 ngày uống TEC- 01 liên tục, quan sát đại thể gan ở hai lô uống thuốc đều không thấy hình ảnh tổn thương. Trên hình ảnh vi thể, phần lớn các tế bào gan bình thường. Tuy nhiên, có thấy một vài hình ảnh sung huyết tĩnh mạch trung tâm, khoảng cửa viêm nhẹ ở cả lô chứng và 2 lô uống TEC-01 (hình 3.11).
Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy TEC-01 chưa thể hiện sự ảnh hưởng đến các chỉ số sinh hóa đánh giá chức năng gan và cấu trúc gan.
4.1.2.4. Ảnh hưởng của TEC-01 đến chức năng thận (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thận là cơ quan bài tiết của cơ thể. Cầu thận và ống thận rất dễ bị tổn thương bởi các chất nội sinh và ngoại sinh, trong đó có thuốc. Thận có đặc điểm dễ bị ngộ độc hơn các mô khác vì là mô có nhiều máu qua nhất. Khi đưa thuốc vào cơ thể, phần lớn các thuốc được đào thải ra ngoài qua thận, nhiều thuốc có thể gây độc cho thận, từ đó ảnh hưởng tới chức năng thận.
Creatinin là một xét nghiệm dùng để đánh giá chức năng lọc của cầu thận. Creatinin là thành phần đạm ở trong máu ổn định nhất, không phụ thuộc vào chế độ ăn, những thay đổi sinh lý mà chỉ phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận. Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ creatinin tăng sớm hơn ure. Do vậy để đánh giá và theo dõi chức năng thận, creatinin máu là chỉ tiêu quan trọng và tin cậy hơn ure [17],[6].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, so sánh hàm lượng creatinin trong máu chuột ở chứng và các lô uống thuốc thử (uống TEC-01 liều 100mg /kg và 300mg /kg) ở thời điểm trước và sau dùng thuốc 14 ngày và 28 ngày không thấy sự thay đổi có ý nghĩa (bảng 3.5).
Quan sát đại thể thận của các lô chuột nghiên cứu đều chưa thấy có biểu hiện bất thường. Cấu trúc vi thể của 30% số chuột thực nghiệm sau uống TEC-01 liên tục 28 ngày vẫn nằm trong giới hạn bình thường, chưa thấy có hình ảnh tổn thương (hình 3.11).
Cho đến nay, trên thế giới và ở Việt Nam chúng tôi chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào về độc tính bán trường diễn của tectorigenin. Trong “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” của Viện Dược Liệu (2004) chỉ nhắc đến độc tính thấp của dịch chiết xạ can mà không đề cập đến độc tính của tectorigenin. Vì vậy chúng tôi không có tài liệu để so sánh.
Kết quả nghiên cứu cho thấy TEC-01 chưa thể hiện sự ảnh hưởng đến tình trạng chung của chuột, các chỉ số về sự gia tăng khối lượng cơ thể, các
chỉ số huyết học, chức năng gan và thận của chuột cũng như mô bệnh học của một số cơ quan.
Thông thường, một hoạt chất có biểu hiện độc tính cấp thì rất có thể sẽ biểu hiện độc tính bán trường diễn. Tuy nhiên, qua kết quả nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bàn trường diễn chúng tôi thu được, TEC-01 đã không tuân theo quy luật đó. Độc tính cấp của TEC-01 sát với mức độc thấp nhưng thuốc không thể hiện độc tính trên thử nghiệm dài ngày. Điều này có thể một phần do ảnh hưởng của động vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng - loại động