2.1. Nội dung, ựịa ựiểm nghiên cứu
2.1.1. Nội dung
2.1.1.1. điều tra thực trạng giết mổ gia cầm tại một số chợ trên ựịa bàn quận Long Biên.
2.1.1.2. Phân lập xác ựịnh tình trạng ô nhiễm Salmonella trên thịt gia cầm tại một số chợ trên ựịa bàn quận Long Biên.
2.1.1.3. Xác ựịnh tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập ựược trên các mẫu thịt gia cầm.
2.1.2. địa ựiểm nghiên cứu:
2.1.2.1. địa ựiểm lấy mẫu tại các chợ trên ựịa bàn quận Long Biên
- Cụm 1: Các chợ thuộc phường đức Giang, Thượng Thanh, Việt Hưng. - Cụm 2: Các chợ thuộc phường Phúc đồng, Phúc Lợi, Sài đồng, Giang Biên. - Cụm 3: Các chợ thuộc phường Thạch Bàn, Cự Khối, Long Biên.
- Cụm 4: Các chợ thuộc phường Ngọc Lâm, Ngọc Thụy, Bồ đề, Gia Thụy.
2.1.2.2. địa ựiểm tiến hành thắ nghiệm:
- Phòng thắ nghiệm bộ môn Thú y cộng ựồng Ờ Khoa Thú y Ờ Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Phòng thắ nghiệm trọng ựiểm công nghệ sinh học cụm II Ờ Khoa Thú y Ờ Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2.2. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
2.2.1. Mẫu thắ nghiệm:
Bao gồm các loại mẫu: - Mẫu thịt;
- Lau thân thịt; - Lau sàn giết mổ;
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 - Lau bàn ựể thịt;
- Lau dao trước giết mổ; - Lau dao sau giết mổ; - Nước dùng trước giết mổ; - Nước dùng sau giết mổ;
2.2.2. Các loại môi trường, hóa chất
Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW)
Môi trường canh Rappaport Ờ Vassiliadis Soya Pepton (RV) Môi trường Muller Kauffman Tetrathionate (MKTTn) Môi trường Xylolysin deoxychocolat (XLD)
Môi trường Brilliant Green Agar (BGA) Môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI) Thuốc thử KovacỖs
2.2.3. Môi trường, hóa chất dùng làm kháng sinh ựồ
Khoanh giấy tẩm kháng sinh: Ampicillin 10ộg, Colistin 10ộg, Amoxilin 20ộg, Enrofloxacin 30ộg, Nalidixic acid 30ộg, Norfloxacin 10ộg, Gentamycin 10ộg, Erythromycin 30 ộg, Tetracycline 30ộg, Streptomycin 10ộg, Sulfamethoxazole - trimethoprim 25ộg.
Thạch Muler Ờ Hinton Nước muối sinh lý 0,85%
2.2.4. Trang thiết bị, dụng cụ
Nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, máy Stomacher, máy li tâm, buồng cấy, máy ựo pH, máy ựếm khuẩn lạc, máy trộn Voltex Ầ
Bình tam giác, ống nghiệm, ựĩa petri, cốc ựong, ống ựong, phễu, pipet, ựèn cồn, que cấy, túi ựựng mẫu, thước ựo vòng vô khuẩnẦ
Tất cả các dụng cụ, hóa chất, môi trường nuôi cấy, môi trường phân lập và giám ựịnh vi khuẩn ựều phải vô trùng tuyệt ựối trước khi sử dụng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
2.3. Phương pháp nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.1. Phương pháp ựiều tra
Tiến hành ựiều tra thực trạng hoạt ựộng giết mổ gia cầm tại các chợ trên ựại bàn một số phường của quận Long Biên bằng hình thức phỏng vấn trực tiếp chủ cơ sở kinh doanh gia cầm.
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu
(Theo theo TCVN 4833-2002 và TT số 61/2010/TT-BNNPTNT ngày 25/10/2010 của Bộ NN&PTNT về việc Quy ựịnh ựiều kiện vệ sinh thú y ựối với cơ sở giết mổ gia cầm)
Các mẫu thắ nghiệm ựược lấy ngẫu nhiên tại một số cơ sở kinh doanh và giết mổ gia cầm trên ựịa bàn quận Long Biên. Mỗi mẫu ựược ựựng vào túi nilon sạch vô trùng, có chứa Pepton ựệm (BPW) và ghi rõ ký hiệu mẫu.
- Lấy mẫu lau dao, lau thân thịt, lau sàn giết mổ, lau bàn bầy bán thịt: sử dụng miếng gạc vô trùng.
- Mẫu nước dùng giết mổ ựược lấy trực tiếp từ nguồn nước máy và nước thải sau giết mổ tại cơ sở.
Các mẫu trên ựược bảo quản trong nhiệt ựộ lạnh (4-8oC) và chuyển về phòng thắ nghiệm ựể xử lý mẫu trong cùng ngày.
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện Salmonella trên ựĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002).
Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và ựồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37o trong 18 Ờ 24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc ựể trộn ựều dịch tăng sinh và chuyển 0,1ml sang ống chứa 10ml môi trường tăng sinh Rappaport - Vassliadis Soya Pepton (RV) ựã ựược ủ ấm ựến 42oC. Sau ựó ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 Chuyển 0,1ml dịch tăng sinh thu ựược vào ống chứa 10ml Muller Kauffmann tetrathionat ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport - Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi trường BGA, ủ 37oC/24 giờ. đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu ựỏ hồng, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLD, ủ 37oC/24 giờ. đọc kết quả: Khuẩn lạc có màu ựen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
Bước 4: Khẳng ựịnh
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men ựược ựường glucoza trong các môi trường trên vì thế phần thạch nghiêng của môi trường có màu ựỏ, phần sâu có màu vàng. đa số các dòng
Salmonella ựều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu ựen trong môi trường này. Vi khuẩn sinh hơi làm rạn nứt thạch môi trường hoặc môi trường bị ựẩy lên tạo một khoảng không dưới ựáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay ựổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường Tryptophan. Ủ ở 37oC trong 24h. Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử KovacỖs. Nếu xuất hiện vòng màu ựỏ - phản ứng dương tắnh. Nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng Ờ phản ứng âm tắnh.
2.3.4. Phương pháp giám ựịnh vi khuẩn Salmonella phân lập ựược
Bao gồm các phương pháp sau:
- Kiểm tra hình thái học, tắnh chất bắt màu, nhuộm gram
- Kiểm tra khả năng di ựộng trên môi trường lỏng và môi trường thạch - Phản ứng sinh Indol
- Phản ứng Oxidaze - Phản ứng Catalaze
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
2.3.5. Phương pháp xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp Bauer - Kirby dùng ựể ựánh giá tắnh mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn mô tả bởi Carter và Cole năm 1990 ựược sử dụng trong thắ nghiệm này. Môi trường tiêu chuẩn dùng ựể thử kháng sinh ựồ theo phương pháp Bauer - Kirby là môi trường Muller - Hinton agar ựược chuẩn bị theo hướng dẫn của nơi sản xuất và ựược ựổ vào ựĩa petri ựảm bảo mặt thạch dày 4 mm. đĩa thạch có ựường kắnh 10 cm cần ựổ 25 ml môi trường, ựĩa có ựường kắnh 15 cm ựổ 60 ml môi trường. Các ựĩa thạch ựược bao gói bảo quản ở nhiệt ựộ 4 - 80C, không quá 2 tuần, trước khi sử dụng ựể tủ ấm 10 - 20 phút. Vi khuẩn cần kiểm tra tắnh mẫn cảm với kháng sinh nuôi cấy trên môi trường lỏng Brain heart infusion (BHI). Dùng micropipet vô trùng chuyển 10 ộl canh trùng lên mặt ựĩa thạch, dàn ựều, ựể yên trong thời gian 3 - 5 phút cho khô mặt thạch. Dùng panh ựặt và cố ựịnh các ựĩa giấy chứa kháng sinh cần kiểm tra sao cho các ựĩa giấy này tiếp xúc với mặt thạch và cách nhau không dưới 15mm, ựể yên 15 - 20 phút rồi lật úp ựĩa thạch, ủ ấm hiếu khắ ở nhiệt ựộ 370C. đọc kết quả sau 18 Ờ 24h bằng cách ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn. Kết quả này ựược so sánh với bảng tiêu chuẩn cho từng loại kháng sinh ựể ựánh giá mức ựộ mẫn cảm của vi khuẩn ựối với kháng sinh ựó.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập ựược xử lý bằng phần mềm Excel 2007.
2.5. Thời gian nghiên cứu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Chương 3