> Các kỹ thuật xét nghiệm truyền thống [1], [36], [88]
Để phát hiện và phân tích các tự KT, người ta có thể dùng rất nhiều phương pháp truyền thống khác nhau. Các phương pháp này dựa trên phản ứng kết hợp KN KT và được sử dụng để định tính và bán định lượng KT trong miễn dịch học, do đó cũng có thể dùng để xét nghiệm tự KT trong các bệnh tự miễn. Các phương pháp được sử dụng bao gồm:
• Các kỹ thuật hỏa miễn dịch cho phép định tính tự KT trong huyết thanh của
người bệnh. Các kỹ thuật này bao gồm: kỹ thuật ngưng kết tiểu phân, đo độ đục miễn dịch, miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, cố định bổ thể, ngưng kết hồng cầu, đếm miễn dịch điện di, western blot, kết tủa miễn dịch, miễn dịch khuếch tán.
• Các kỹ thuật định lượng miễn dịch (immunometric) còn cho phép định lượng
tự KT có mặt trong huyết thanh người bệnh. Các kỹ thuật này bao gồm: kỹ thuật
miễn dịch phóng xạ, miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch gắn enzyme (ELISA), phân tích miễn dịch phát quang hóa học.
> Các kỹ thuật mới [15], [16J, [36], [88]
Các kỹ thuật mới này vẫn dựa trên nguyên tắc của một số kỹ thuật cũ như: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme, kỹ thuật western blot nhưng có những cải tiến mới để có thể định tính hoặc định lượng cùng lúc nhiều chất cần phân tích. Sau đây là một số kỹ thuật mới nhằm tăng số lượng chất phân tích trong một lần làm xét nghiệm:
• Sử dụng tế bào được chuyển nhiễm DNA (transfected cell substrates): DNA
vòng mã hóa cho chất cần phân tích được chuyển nhiễm vào các tế bào. Sau đó, các tế bào chuyển nhiễm mang tự KN này được sử dụng để phát hiện tự KT bằng phương pháp miễn dịch thích hợp (huỳnh quang hay miễn dịch gắn enzyme).
• Sử dụng các mảng mô và tế bào (Cell and tissue arrays) [36]: Các tế bào và
các mô có nguồn gốc khác nhau được phân bố vào một bảng gồm các giếng và được sử dụng làm chất nền để phát hiện tự KT bằng các phương pháp thích họp. Những dụng cụ phân tích dùng các mảng tế bào và mô đã được một số nhà sản xuất đưa ra thị trường (BIOCHIP - Euroimmun).
• Kỹ thuật miễn dịch dải băng (Line Immunoassay) [36]: Trong kỹ thuật này,
người ta dùng một tấm plastic được phủ nitrocellulose. Các tự KN tinh khiết được đưa lên pha rắn này thành từng đường mảnh ở vị trí đặc biệt trên pha rắn. Sau đó, tấm plastic được cắt ra thành nhiều dải nhỏ và tự KN được sử dụng để phát hiện tự KT tương tự như phương pháp Western blot.
• Laser microbead army: Kỹ thuật này sử dụng các vi cầu (kích thước cỡ 5-
8|im) được nhuộm bởi 2 màu huỳnh quang đỏ và da cam với tỷ lệ khác nhau, có thể tạo ra 1 0 0 vi cầu có màu sắc khác nhau (nhận biết màu bằng máy đo huỳnh quang). Mỗi loại vi cầu sẽ được gắn với một tự KN đặc hiệu. Các hạt này sẽ được cho tiếp xúc với mẫu thử (dịch huyết thanh). Các tự KT nếu có sẽ gắn với các tự KN tương ứng. Tự KT này cũng sẽ được gắn với một chất đánh dấu huỳnh quang. Sau đó, các hạt này được cho đi qua một máy phân tích (flow dual laser cytometry) nhận biết huỳnh quang phát ra từ vi hạt và từ chất đánh dấu, cho phép định tính và định lượng K T .
• Sử dụng mảng KN trên mặt phăng (antigen array on planar surfaces): Trong
kỹ thuật này, các tự KN tinh khiết (chỉ cần dùng ở nồng độ nano) được chấm lên những vị trí đặc hiệu trên một chấm nhỏ. Chấm nhỏ này nằm trên một mảnh (slide) có kích thước ở mức độ hiển vi (hoặc có thể dùng màng nitro cellulose). Người ta dùng một lượng lớn tự KN (50-200 KN) và làm nhiều slide trong một lần phân tích để tăng tính đồng bộ cho kết quả. Bất cứ tự KT nào gắn với KN đều được phát hiện bằng KT IgG (hoặc IgM) đánh dấu. Chất đánh dấu có thể là chất nhuộm huỳnh quang hoặc là enzyme (ví dụ như phosphatase kiềm).
• Kỹ thuật “vi dịch thể” (Microfluidics) [36]: Kỹ thuật này còn được nhắc tới với tên “kỹ thuật lab - on - chip”. Trong phương pháp này, huyết thanh (có tự KT cần phân tích) được cho vào một vị trí trên chip và tự KN được cho vào ở vị trí khác. Dưới ảnh hưởng của sức điện động, các tác nhân (tự KN, KT, chất điện giải, chất phân tích) sẽ di chuyển lại gần nhau và gắn với nhau. Phức họp KN - KT hình thành sẽ được phát hiện nhờ tính chất hóa lý của chúng.
• Kỹ thuật nano và kỹ thuật mã vạch nano (Nano technology và nanobarcode
particle) [36]:
Kỹ thuật nano có hai phương pháp: Phương pháp thứ nhất tưoTig tự như phương pháp antigen microarray trên mặt phẳng. KN được cố định trên vi mặt phẳng và KT được phát hiện nhờ KT đánh dấu gắn huỳnh quang và vị trí của KN. Phương pháp thứ hai, người ta dùng KN gắn với các vạch kim loại nằm ttên các tiểu phân có kích thước hiển vi hoặc dưới mức hiển vi. Huyết thanh và các KT đánh dấu (dùng để phát hiện tự KN) gắn huỳnh quang sẽ có các hệ số phản xạ khác nhau. Hình ảnh phản xạ này giống các mã vạch (do dùng các vạch kim loại gắn KN-KT-KT đánh dấu). Các mã vạch này đặc trưng cho tự KT cần phát hiện.
2.4.3. Các kỹ thuật sinh thiết, các kỹ thuật sinh học [1]
Các kỹ thuật này dùng để xác định tình trạng viêm và tổn thương của mô, tình trạng thâm nhiễm các tế bào miễn dịch trong m ô...
> Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (immunohistochemisíry)
Kỹ thuật này cho phép phân biệt các loại tế bào thâm nhiễm vào mô đem sinh thiết. Người ta sử dụng các KT đơn dòng đánh dấu bằng huỳnh quang hoặc đồng vị
phóng xạ kháng lại các KN trên bề mặt các tế bào khác nhau, hoặc kháng lại các loại cytokine do các tế bào này tiết ra.
> Kỹ thuật lai bằng DNA
Phương pháp này sử dụng các đoạn DNA bổ sung với các đoạn RNA mã hóa các phân tử do các tế bào miễn dịch tiết ra. Khi tế bào tạo ra RNA để tổng hợp các phân tử hiệu ứng thì mảnh DNA bổ sung này (còn gọi là mảnh DNA dò) sẽ liên kết với phân tử RNA này và có thể phát hiện được sự liên kết này.
> Kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Từ miếng sinh thiết, tách lấy tế bào và nuôi cấy thì có thể xác định trong nước mặt môi trường các chất tiết của chúng như các cytokine, các tự KT... bằng các kỹ thuật định tính thông thưòng.
> Kỹ thuật phân tích DNA bằng PCR
Nếu tách được DNA tò các tế bào thâm nhiễm thì có thể dùng kỹ thuật phản ứng khuếch đại chuỗi với polymerase. Do đó, có thể phân tích được những thay đổi của các phân tử của hệ miễn dịch, chẳng hạn các TCR, các KT...
2.5. Điều trị bệnh tự miễn
Hiện nay, việc điều trị bệnh tự miễn còn gặp nhiều khó khăn và chủ yếu là điều trị triệu chứng. Ví dụ: sử dụng insulin trong TID, sử dụng các thuốc NSAID trong RA, sử dụng các thuốc kháng giáp trạng trong bệnh Graves... Tuy nhiên, số lưọTig bệnh tự miễn rất lớn, ngày càng có nhiều bệnh được xếp vào danh sách bệnh tự miễn, bệnh tự miễn lại có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan trong cơ thể: các tuyến nội tiết, ngoại tiết, tim mạch, thận, gan, khớp, da, thần kinh... tạo ra rất nhiều triệu chứng khác nhau nên ở đây không thể đề cập đến việc điều trị triệu chứng cho từng bệnh tự miễn. Sau đây là một số xu hưóng điều trị chung cho các bệnh tự miễn dựa vào nguyên nhân và cơ chế của bệnh.
2.5.1. Sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch và chống viêm
> Corticoỉd[57], [67]
Corticoid được coi là thuốc điều trị chủ yếu và cơ bản trong rất nhiều bệnh tự miễn dựa vào khả năng ức chế miễn dịch và chống viêm của chúng.
Cơ chế tác dụng: Glucocorticoid gắn với phức họp gồm receptor của glucocorticoid, protein sốc nhiệt 90 và phân tử immunophilin 59. Sự gắn kết này
giải phóng phức họp glucocorticoid và receptor của nó. Phức họp này sẽ được chuyển vào nhân, làm thay đổi sự tổng họp protein do ức chế yếu tố nhân kB. Đây là một yếu tố dịch mã có chức năng điều hòa các gen liên quan đến miễn dịch và viêm như gen mã hóa IL-2, IL-6, ĩ>fC^5yàthase và phospholipase A2. Sự ức chế yếu tố nhân kB tác động lên hệ miễnỊ địch ra tác dụng ức chế miễn dịch của corticoid:
• Giảm sản xuất các cytokine tiền viêm như IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-a, IFN-ỵ, đồng thời tăng cường bộc lộ chất chẹn receptor của IL-1 (IL-lRa).
• Thay đổi sự tập trung và hoạt hóa các tế bào gây viêm như bạch cầu đơn nhân, ĐTB, bạch cầu kiềm và các tế bào lympho.
• Giảm bộc lộ các phân tử kết dính trên bề mặt các tế bào nội mô, ức chế sản xuất các chemokine do đó làm giảm sự tập trung của các BCTT ở các vị trí viêm.
• ứ c chế quá trình bộc lộ gen trong bào tương và sự tạo thành phospholipase A2, cyclooxygenase-2 và NO-synthase, do đó làm giảm sản xuất các yếu tố gây viêm như prostaglandin, thromboxane, leukotriene và NO.
> Cyclosporin A [12], [57], [59], [65Jf [67]
Cyclosporin là thuốc ức chế calcineurin, một protein phosphatase có vai trò hoạt hóa yếu tố nhân kB, do đó, thuốc có khả năng ức chế miễn dịch nhờ ức chế sự tăng sinh và chức năng của các tế bào T. Cyclosporin còn có khả năng chống viêm do hoạt hóa gen mã hóa TGpp ở nhiều loại tế bào khác nhau, từ đó ức chế hoạt động của các chất gây viêm như NO-synthase và phospholipase A2 hòa tan.
Cyclosporin được sử dụng trong điều trị nhiều bệnh tự miễn như SLE, RA, bệnh Behcet, bệnh thận tự miễn, bệnh vảy nến, viêm da tự miễn, TID, MG, viêm phế nang xơ hóa, viêm mổng mắt, bệnh Graves, viêm đa mạch, viêm gan tắc mật nguyên phát, bệnh Crohn...
> Các thuốc ức chế tổng hợp mới purine, pyrimidine [19], [41], [57], [83]
Các thuốc trong nhóm này ức chế đáp ứng miễn dịch do ức chế tổng họp mới purine và pyrimidine cần thiết cho sự tăng sinh và hoạt hóa của các tế bào T. Các thuốc trong nhóm này được liệt kê trong bảng 1 0:
Bảng 10. Các thuốc ức chế tổng họp mới purine và pyrimidine
Thuốc Cơ chê Các bênh đươc điêu tri
Mycophenolic mofetil ứ c chế IMP-DH Pemphigus, vảy nên nặng (thử nghiệm).
Mizoribine ứ c chế IMP-DH SLE, RA (thử nghiệm)
Leflunomide ứ c chế DHO-DH
ứ c chế hoạt động của cycloxygenase-2
Tăng mRNA mã hóa IL-10
Động vật: SLE, EAE, viêm màng mạch nho...
Người: RA, SLE, bệnh hủy bạch cầu hạt Wegener, bệnh Crohn (thử nghiệm)
Azaribine ứ c chế OMP-decarboxylase Vảy nên, RA (thử nghiệm)
Azathiprine 6-Mercaptopurine ứ c chế tổng họp adenosine và guanosine. Làm sai lệch tổng hợp protein. RA, SLE.
IMP-DH: IMP-dehydrogenase (tham gia sinh tổng hợp purine); DHO-DH: DHO-dehydrogenase (tham gia sinh tổng hợp pyrimidine); OMP-decarboxylase: tham gia tổng họp pyrimidine.
> Các thuốc ức chế miễn dịch khác [19], [25], [40], [42], [57], [64], [65]
Ngoài các thuốc trên, các thuốc ức chế miễn dịch trình bày trong bảng 11 cũng được sử dụng hoặc thử nghiệm trong điều trị bệnh tự miễn;
Bảng 11. Các thuốc ức chế miễn dịch khác, cơ chế, và ứng dụng trong điều trị
Thuôc Cơ chê Bênh đươc điêu tri
Tacrolimus ứ c chế calcineurin=> ức chế hoat hóa tế bào T
Phối hợp với corticoid điều trị các bệnh tự miễn
Methotrexate Tích lũy dihydrofolate => tăng AICAR nội bào=> giải phóng adenosine vào dịch viêm=> gắn với receptor tương ứng=> ức chế ĐTB tiết cytokine viêm, các chất hóa ứng động; ức chế TB lympho tăng sinh.
Cyclophosphamide Liên kết với chuỗi DNA, ức chế sao chép của TB lỵmpho=>ức chế miễn dịch.
Hydroxychloroquine Ảnh hưởng hoạt động lysosome=>ức chế chức năng TB lympho và ĐTB .
D-Penicillamine Bẻ gãy liên kết S-S, phá vỡ cấu trúc của IgM, thay đổi cấu trúc receptor của tế bào T và bạch cầu đon nhân. Sulfasalazine Điều hòa miễn dịch và chống viêm.
Everolimus Sirolimus
Gắn với receptor FKBP12 =>ửc chế tế bào tăng sinh. FTY 720 Giảm bộc lộ phân tử kêt dính hoặc receptor hướng
đích (homing receptor) =>Giảm sự di chuyển của TB lỵmpho tự phản ứng đến mô đích.
Thử nghiệm lâm sàng điều trị MS
Dan chất statin ứ c chế HMG-CoA reductase=> giảm phát triển và biệt hóa ĐTB.
ứ c chế bộc lộ MHC-II, LFA-1=> ức chế hoạt hóa Thi. ứ c chế sự di chuyển TB lympho, ức chế tiết chemokine.
Bảo vê TB thần kinh.
Thử nghiệm trên RA, MS, EAE, hội chứng kháng phospholipid
Thiazolidindione Gắn với PPAR-y => tăng cưòng apoptosis ờ tế bào lympho và ĐTB, ngăn cản hoạt hóa ĐTB, ức chế sản xuất cytokine.
Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II điều trị MS
AICAR: 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotid. HMG-CoA: hydroxymethylglutaryl-coenzyme A
2.5.2. Tăng cường loại bỏ tự kháng thể [1], [10], [30], [65], [77]
Trong một số bệnh tự miễn KT có vai trò bệnh sinh (trực tiếp hoặc gián tiếp qua các phức hợp miễn dịch), ta có thể làm giảm bớt ĐƯMD bằng cách loại bỏ tự KT ra khỏi cơ thể hoặc ức chế sản xuất tự KT. Các phương pháp này bao gồm:
> Thay thế huyết tương để loại bỏ các tự KT và các thành phần sinh bệnh khác như các cytokine, bổ thể... đã được sử dụng hiệu quả trong điều trị SLE [65].
> Sử dụng LJP394, một chất có cấu trúc như một khung polyethylen glycol gắn với DNA. Chất này sẽ loại bỏ chọn lọc tự KT kháng DNA ra khỏi cơ thể. Chúng hình thành các phức họp hòa tan với tự KT. Phức hợp này không hoạt hóa hệ thống bổ thể, do đó, không gây tổn thưong cho thận. Ngoài ra, chất này liên kết chéo với BCR (B cell Receptor - Receptor của tế bào B), làm bất ứng hoặc loại bỏ tế bào B (nhờ apoptosis) [65]. LJP394 đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III trong điều trị SLE [10], [30], [65].
> Sử dụng Ig tiêm tĩnh mạch có tác dụng làm giảm sản xuất tự KT. Ig tiêm tĩnh mạch có các KT kháng idiotype (kháng tự KT). Sự hình thành phức hợp tự KT (idiotype) và KT kháng idiotype giúp trung hòa, không cho tự KT gắn với KN. Phần Fc của phức hợp này còn gắn với FcR trên các tế bào thực bào, đẩy nhanh sự loại bỏ tự KT và gắn với FcR trên các tế bào B, làm giảm sản xuất tự KT. Ngoài ra, Ig tiêm tĩnh mạch còn có thể hòa tan phức họp miễn dịch lắng đọng ở các tổ chức, ức chế gắn bổ thể, ức chế sản xuất cytokine viêm và ức chế bộc lộ các phân tử kết dính. Những nghiên cứu gần đây còn cho rằng, Ig tiêm tĩnh mạch có ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng sinh và hoạt hóa tế bào B. Phương pháp tiêm tĩnh mạch Ig đã được thử nghiệm và ứng dụng trên rất nhiều bệnh tự miễn khác nhau bao gồm SLE, RA, viêm đa cơ, viêm da cơ, viêm mạch, MS, MG, thiếu máu tan huyết, xuất huyết giảm tiểu cầu...[l], [77].
2.5.3. Điều trị bằng các chất đối kháng cytokine hoặc các cytokine chống viêm
Trong bệnh tự miễn, người ta nhận thấy có sự bất thường của hệ thống các cytokine. Sự bất thường này có thể là do nguyên nhân bên trong hoặc bên ngoài gồm: gen, nhiễm khuẩn, nhiệt độ, phóng xạ, thuốc, tuổi tác, thai nghén... Để điều trị
bệnh tự miễn, ta có thể sử dụng các chất đối kháng với cytokine hoặc sử dụng bổ sung cytokine để đưa hệ thống cytokine về trạng thái cân bằng [75].
> Chất đối kháng với TNF-a [10], [21], [58], [63], [65], [79]
TNF-a là yếu tố chính tham gia vào các phản ứng viêm bằng các cơ chế: hấp dẫn và hoạt hóa BCTT và bạch cầu đơn nhân, tăng cường bộc lộ các phân tử kết dính trên bề mặt các tế bào biểu mô để hấp dẫn bạch cầu, kích thích các tế bào biểu mô và ĐTB tiết ra các chemokine. Ngoài ra, TNF-a còn cảm ứng apoptosis ở một số loại tế bào. Sử dụng các chất đối kháng với TNF-a sẽ ngăn chặn và làm giảm bớt phản ứng viêm thường gặp trong bệnh tự miễn.
Các chất ức chế TNF-a được sử dụng bao gồm các receptor hòa tan của TNF-a (receptor p55 hay receptor p75 hòa tan) và các KT kháng TNF. Các chất này làm mất tác dụng của TNF-a do ức chế TNF-a gắn vào receptor của chúng trên tế bào (hình 1 1) ■ 7 H li tn r | t^ k¿ k l 1^11 L| TI4F ĩ Illlí Ximil h A d a h m u mal>
Hình 11. TNFa, các receptor tương ứng và các chất đối kháng