KHOA SINH HỌC
KHOA SINH HỌC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1.1. Dịch tễ học
1.2. Tổng quan về BKV
Hình 1. 1. Cấu trúc virion BKV [3]
Hình 1. 2. Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV [3]
Đáp ứng miễn dịch tự nhiên
Đáp ứng miễn dịch thích ứng
Đáp ứng dịch thể
Đáp ứng miễn dịch tế bào
1.3. Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận
1.4. Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV
1.4.1. Tế bào học
1.4.2. Sinh thiết thận
Hình 1. 3. Các tế bào decoy trong nước tiểu [71].
1.5. Tình hình nghiên cứu BKV
1.6. Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh
Chương 2
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
2.1.2. Các vật liệu
+ Bộ mẫu chuẩn được thiết lập bởi hãng Altona (RealStar® BKV PCR Kit, Đức, 2018)
Hình 2. 1. Vector pGEM T easy
Bảng 2. 1. Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
2.2. Thiết bị chính
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Bảng 2. 3. Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1
Phương pháp tạo tế bào khả biến
Phương pháp biến nạp
Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào qua đêm
Tách plasmid
Đánh giá độ đặc hiệu
Hiệu chỉnh nồng độ theo bộ mẫu chuẩn của WHO
+ Thiết lập panel mẫu chuẩn nghiên cứu (LDA)
Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR
Bảng 2. 4. Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm
So sánh bộ mẫu chuẩn nghiên cứu với bộ mẫu chuẩn thương mại
Xác định giá trị ngưỡng nồng độ BKV-DNA dự đoán BKVN
Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng
Chương 3
3.1. Xây dựng quy trình định lượng BKV-DNA bằng real-time PCR
Hình 3. 1. Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng
Biến nạp
Hình 3. 2. Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường LB đặc/IPTG/Xgal
Hình 3. 4. Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen Quốc tế bằng phần mềm Blast
Hình 3. 5. Kiểm tra lại trình tự mồi và probe cho real-time PCR
Hình 3. 6. Tối ưu nồng độ probe
Hình 3. 7. Tối ưu nồng độ mồi
Bảng 3. 1. Thành phần phản ứng real-time PCR
Bảng 3. 2. Đánh giá độ đặc hiệu
Hiệu chỉnh nồng độ mẫu chuẩn theo bộ mẫu chuẩn của WHO
Hình 3. 8. So sánh sự tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và LDA
Khảo sát khoảng định lượng và xác định ngưỡng phát hiện
Hình 3. 9. Xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn
Bảng 3. 3. Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm
Đánh giá độ ổn định
Bảng 3. 4. Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl
So sánh với kit thương mại Realstar BKV PCR Kit
Hình 3. 11. So sánh sự tương quan giữa hai bộ kit
3.2. Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV
Bảng 3. 5. Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận
Hình 3. 13. Đường cong ROC BKV-DNA trong máu nhằm phát hiện BKVN
Bảng 3. 6. So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng
Bảng 3. 7. Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép thận
3.3. Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV
Hình 3. 15. Cây phát sinh loài trên vùng gen VP1-BKV (1630-1956)
Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV
Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956)
Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV
Phân tích SNP ở những bệnh nhân BKVN trong mẫu máu và nước tiểu
Bảng 3. 13. So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu
Bảng 3. 14. Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Anh