Cây chủng loại phát sinh được xây dựng dựa trên vùng trình tự 327 bp thuộc vùng gen VP1, bao gồm 26 trình tự tham chiếu được công bố trên Genbank cùng với kết quả giải trình tự của 40 mẫu dương tính với BKV bằng phương pháp Nested PCR (Hình 3.15).
Hình 3. 15. Cây phát sinh loài trên vùng gen VP1-BKV (1630-1956)
Bảng 3. 8. Sự phân bố các phân nhóm của BKV
BKV-I (n=25) BKV-IV (n=15)
I/a I/-b1 I/b-2 I/c IV/a-1 IV/a-2 IV/b-1 IV/c-1 IV/c-2 0
(0%)
25 (100%)
0 (0%)
0 (0%)
4 (26,67%)
1 (6,67%)
0 (0%)
10 (66,66%)
0 (0%) Kết quả phân tích bằng cây chủng loại phát sinh cho thấy: 25 mẫu (62,5%) thuộc BKV-I, 15 mẫu (37,5%) thuộc BKV-IV, không phát hiện được BKV-II, III trong các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam. Phân tích sâu hơn về trình tự dưới loài, 27/27 mẫu BKV-I thuộc về phân nhóm I/b-1, không phát hiện được các phân nhóm I/b-2, I/a hay I/c. Tuy nhiên, BKV-IV thể hiện sự đa dạng các phân nhóm cao hơn: 10 mẫu thuộc phân nhóm IV/c-1, 4 mẫu thuộc phân nhóm IV/a-1 và 1 mẫu thuộc nhóm IV/a-2 (Bảng 3.8). Một số trình tự trong nghiên cứu này đã được đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế với các mã số như MF817712.1, MH019287.1, MH019286.1, MH019285.1…, cung cấp nguồn dữ liệu phân tử quan trọng cho những nghiên cứu dịch tễ học về BKV tại Việt Nam.
BKV có 4 kiểu gen chính là BKV-I, II, III, IV lưu hành trên thế giới và sự phân bố của các kiểu gen cũng như các phân nhóm phụ thuộc vào các vùng địa lý khác nhau. Trong đó, BKV-I phổ biến nhất trên toàn thế giới, chiếm tỷ lệ 70%-80%
[80], tiếp đến là BKV-IV chiếm 15%-25%, được phát hiện ở Châu Âu, Châu Á nhưng không phát hiện ở Châu Phi. BKV-II và BKV-III rất hiếm gặp ở mọi vùng địa lý [44]. BKV-I có 4 phân nhóm gồm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c nhưng nguồn gốc và sự phân bố của các phân nhóm là khác nhau. Phân nhóm I/a có nguồn gốc ở Châu Phi, I/b-1 có nguồn gốc từ Đông Nam Á, I/b-2 đến từ châu Âu và I/c chủ yếu ở Đông Bắc Á. Trong nghiên cứu này, khi phân tích trình tự DNA của vùng gen VP1 cho thấy BKV-I là kiểu gen chiếm ưu thế (62,5%), tiếp đến là BKV-IV (32,5%).
Phân tích sâu hơn để xác định phân nhóm, 25/25 mẫu thuộc BKV-I ở những bệnh nhân ghép thận tại miền Bắc trong nghiên cứu này đều thuộc nhóm I/b-1. Kết quả này phù hợp với sự phân bố kiểu gen BKV trên thế giới cũng như nguồn gốc và sự phân bố nhóm I/b-1 ở Đông Nam Á trong các nghiên cứu trước đây [22], [44], [92].
3.3.2. Phân tích các vị trí SNP-BKV trên vùng gen VP1 ở bệnh nhân ghép thận Các khu vực đa hình gen dẫn tới các kiểu đột biến khác nhau ở những vị trí địa lý khác nhau. Phân tích cây chủng loại phát sinh cho thấy, BKV lưu hành tại Việt Nam chỉ thuộc kiểu gen I và kiểu gen IV, do đó dựa vào đoạn trình tự 327 bp, tương ứng với trình tự nucleotide ở vị trí 1630-1956 được phân tích để xác định sự khác biệt giữa BKV-I và BKV-IV. Kết quả phân tích từ 26 trình tự tham chiếu và 40 trình tự chứa đoạn gen VP1 phân lập tại Việt Nam có kích thước 327 bp (1630 - 1956) được thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3. 9. Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV Vị trí SNP Vị trí aa BKV-I BKV-IV Thay đổi aa
1704 47 G A
1716 51 C T
1722 53 C T
1744 61 G A E=>N/S
1746 61 A T
1747 62 A G N=>D
1760 66 T A E=>Y
1769 69 A G K=>R
1770 69 G A
1775 71 G C S=>T
1784 74 A C N=>T
1787 75 A C
1792 77 A G S=>D/N/E/Q/H
1793 77 G A
1809 82 G/A C E=>D
1848 95 C A
1851 96 C A/G
1854 97 C T
1869 102 C T
1890 109 G A
1912 117 C A Q=>K
1938 125 C T
Sau khi so sánh, 22 vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen I và IV đã được phát hiện (bảng 3.9). Trong số đó, 10 SNP làm thay đổi trình tự axit amin capsid của BKV (1746, 1747, 1760, 1769, 1775, 1784, 1792, 1793, 1809, 1912). Nghiên cứu của Preety M. Sharma và cộng sự (2006) [4] ở tiểu bang Pennsylvania, Hoa Kỳ phát hiện 10 vị trí SNP khác nhau giữa BKV-I và BKV-IV từ vị trí 1630-1956, trong đó 9/10 SNP (1704, 1722, 1747, 1760, 1769, 1770, 1784, 1851, 1854) trùng với SNP trong nghiên cứu này. Vị trí SNP khác biệt duy nhất ở vị trí 1912, khi có sự thay đổi nucleotide C=>A (BKV-I => BKV-IV), trong khi đó ở nghiên cứu của Preety M.
Sharma không có sự khác biệt ở vị trí nucleotide 1912 giữa BKV-I và BKV-IV. Tuy nhiên, trong nghiên cứu Luo C và cộng sự (2008) [58], có sự thay đổi nucleotide 1912 từ C=>A giữa hai kiểu gen I và IV. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng đồng nhất với các kết quả nghiên cứu khác trên thế giới [62].
25 mẫu BKV-I tiếp tục được so sánh với chủng Dunlop và các chủng quốc tế thuộc phân nhóm I trong vùng gen VP1 (1630-1956) để xác định vị trí đa hình. Kết quả so sánh được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3. 10. Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956) SNP Dunlop
(I/a)
AB211369 (I/b-1)
AB211370 (I/b-2)
AB211372 (I/c)
Mẫu NC Tần số
1698 T A A A A 25/25
1786 G G G G A/G 5/25,
20/25
1809 G A A G A 25/25
1923 T C C T C 25/25
1929 A A A A A/G 24/25,
1/25 Kết quả phân tích cho thấy 5 vị trí khác biệt giữa phân nhóm I/b-1 (Việt Nam) so với chủng Dunlop (bảng 3.10), với 3/5 vị trí khác biệt (1698, 1809, 1923) tương đồng với chủng tham chiếu I/b-1. Các phân nhóm I có trình tự khá bảo thủ,
trong đó phân nhóm I/b-1 Việt Nam tương đồng khoảng 98,5% so với chủng Dunlop, không có sự khác biệt SNP đặc trưng BKV-I trong vùng gen VP1 (1630- 1956) để phân biệt các phân nhóm với nhau. Tuy nhiên, ở vị trí 1786 (tương ứng với axit amin 75) trên một số chủng Việt Nam, xuất hiện vị trí SNP (G=>A), làm thay đổi axit amin Asp=>Asn, với tần số 5/25 mẫu (20%). Đây là vị trí SNP hiếm, không nằm trong phạm vi SNP mà Jin và cộng sự đã mô tả năm 1993 nhằm phân biệt các kiểu gen BKV [47], nhưng đã được Tremolada S và cộng sự (2010) ghi nhận là kiểu đột biến hiếm và thường xuất hiện trong nước tiểu ở những bệnh nhân BKVN [84].
Từ kết quả cây chủng loại phát sinh, 15 trình tự BKV-IV đều thuộc ba phân nhóm IV/a-1, IV/a-2, IV/c-1. Do đó, để khảo sát sự đa dạng trình tự nucleotide trong phân nhóm IV, 15 trình tự BKV-IV trong nghiên cứu này tiếp tục được so sánh với các phân nhóm IV/a-1 (AB269869), IV/a-2 (AB211389), IV/c-1(AB269867) quốc tế. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.11 và 3.12.
Bảng 3. 11. Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV