- Thực nghiệm mô tả và phân tích trong phòng thí nghiệm với các kỹ thuật vi sinh và sinh học phân tử.
- Xử lý thống kê sinh học (SPSS version 20): Kiểm định khi bình phương cho biến định tính, T student và Mann- Whithney cho biến định lượng, đường cong ROC với khoảng tin cậy 95%, ý nghĩa thống kê được công nhận với ngưỡng p<0,05.
- Phân tích trình tự gen: Bioedit, Mega 7.
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu
Tách chiết BKV-DNA từ mẫu huyết tương hoặc nước tiểu
PCR với cặp mồi đặc hiệu BKV
Thiết kế mồi, probe cho real-time PCR
Tối ưu kỹ thuật real-time PCR
Phân tích ý nghĩa kiểu gen BKV với BKVN và các yếu tố lâm sàng khác
Đánh giá mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng
33
Độ đặc hiệu, độ nhạy, ngưỡng phát
hiện, độ ổn định
Hiệu chỉnh nồng độ chuẩn theo
So sánh với kit thương mại
34
2.3.2. Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR 2.3.2.1.Tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm (máu hoặc nước tiểu) bằng bộ kit
Exgene™ Blood SV (GeneAll, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như
sau:
Bước 1: Hỳt 20 àl protein K, 200 àl bệnh phẩm (huyết tương hoặc nước tiểu) và 200 àl Buffer AL vào ống eppendorf 1,5 ml. Vortex hỗn hợp 4-6 giõy, ủ 56oC trong 10 phút.
Bước 2: Thờm 200 àl ethanol 96% vào hỗn hợp, chuyển dịch lờn Spin column. Ly tâm 8.000 rpm, 1 phút. Loại bỏ Collection tube chứa dịch.
Bước 3: Thờm 600 àl Buffer BW vào Spin column. Ly tõm 8.000 rpm, 1 phút.
phút.
Bước 4: Thờm 700 àl Buffer TW vào Spin column. Ly tõm 8.000 rpm, 1
Bước 5: Chuyển Spin column sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thờm 54 àl Elution Buffer, ủ ở nhiệt độ phòng từ 2-5 phút. Ly tâm 14.000 rpm, 1 phút.
Bước 6: DNA được bảo quản ở -20oC.
2.3.2.2.Phương pháp PCR
PCR là một chuỗi phản ứng bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau nhằm nhân đoạn gen mong muốn qua các chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm có ba bước chính: biến tính, khuếch đại và kéo dài. Trong nghiên cứu này, phương pháp PCR được sử dụng nhằm thu sản phẩm khuếch đại gen VP1 với kích thước vòng ngoài 580 bp (đoạn chèn cho vector tách dòng) và vòng trong 327 bp (phân tích kiểu gen).
Để giảm thiểu sự ức chế trong các mẫu nước tiểu cũng như nhằm tăng hiệu quả khuếch đại PCR, mẫu bệnh phẩm được thực hiện Nested PCR với các cặp mồi đặc hiệu BKV (Bảng 2.2). Sau khi tinh sạch sản phẩm Nested PCR và giải trình tự,
so sánh trình tự và xây dựng cây chủng loại phát sinh nhằm xác định kiểu gen BKV của bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam. Thành phần PCR và Nested PCR được thể hiện ở bảng 2.3.
Bảng 2. 3. Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1
Vòng 1 Vòng 2
Hóa chất Thể tích Hóa chất Thể tích
Master mix Gotaq Green 10 Master mix Gotaq Green 10
P(BKS+AS) 1 P(F1+R1) 1
Nước 4 Nước 7,5
DNA 5 DNA 1,5
Điều kiện: (95oC, 5’) (94oC30’’, 56oC30’’, 72oC30’’) (72oC, 7’)
Điều kiện: (95oC, 5’) (94oC30’’, 42oC30’’, 72oC30’’) (72oC, 7’)
2.3.2.3.Tinh sạch PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR giúp loại bỏ các thành phần dư thừa của phản ứng PCR, qua đó tạo điều kiện lai tốt nhất. Mặt khác, tinh sạch còn giúp loại bỏ các sản phẩm PCR không đặc hiệu, tránh trường hợp DNA tái tổ hợp chứa đoạn chèn không mong muốn. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR bằng GeneJET PCR Purification Kit như sau:
- Bước 1: Thêm PB Buffer vào ống đựng sản phẩm PCR theo tỷ lệ 5:1
- Bước 2: Chuyển hỗn hợp lên Binding Column tube và ly tâm 13.000 rpm, 1 phút.
- Bước 3: Chuyển Binding Column sang tube mới. Thờm 500àl WB Buffer, ly tõm 13.000 rpm, 1 phút.
- Bước 4: Lặp lại bước 3
- Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút
- Bước 6: Chuyển Binding Column sang ống eppendorf 1.5 ml, thờm 30àl Elution Buffer, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Bước 7: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút, bỏ Binding Column, thu dịch và bảo quản ở -20oC.
Chất lượng của sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
2.3.2.4.Phương pháp điện di
Điện di là phương pháp phổ biến để phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Sau khi PCR, sản phẩm khuếch đại gen VP1 (580 bp) và sản phẩm Nested PCR (327bp) nhằm tăng hiệu quả khuếch đại gen VP1 được điện di trên gel agarose 1,2%; 110V, đệm TBE 0,5X. Mặt khác, sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp được thực hiện trên gel 1%. Gel agarose được ngâm EtBr 30 phút, các sản phẩm được quan sát, phân tích bằng máy UV vis.
2.3.2.5.Tách dòng gen
Phương pháp tạo tế bào khả biến
Tế bào khả biến có khả năng nhận plasmid tái tổ hợp được chuẩn bị như sau:
+ Chủng vi khuẩn E. coli DH5α được cấy ria trên đĩa LB đặc và nuôi cấy qua đêm ở 37oC.
+ Cấy một khuẩn lạc đơn trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC. Chuyển 300 àl dịch nuụi cấy qua đờm vào 15 ml LB lỏng (tỷ lệ 1:50), lắc tiếp ở 37oC, tốc độ 200 vòng/phút đến khi A260 đạt 0,4-0,6 thì chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá.
+ Ly tâm 5000 vòng/phút, 4oC, 10 phút, thu cặn tế bào. Hòa cặn trong 9 ml hỗn hợp dung dịch (MgCl2 80 Mm và CaCl2 20 Mm), ly tâm 5000 vòng/phút, 4oC, 10 phỳt để thu cặn. Hũa cặn trong 600 àl CaCl2 100 Mm.
+ Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 600 nm. Pha loãng dịch trên về A260=1 bằng glycerol 15%. Chia dịch vi khuẩn trờn vào cỏc ống eppendorf (100 àl – 150 àl/ống) được giữ lạnh trờn đỏ. Bảo quản ở -80oC.
Phương pháp biến nạp
Sản phẩm của phản ứng nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phương pháp sốc nhiệt. Các tế bào vi khuẩn đã được xử lý với CaCl2 có màng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA plasmid có thể chui qua các lỗ trên màng khi nhiệt độ thay đổi đột ngột. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt gồm các bước cơ bản sau:
+ Tế bào khả biến E. coli được lấy ra từ tủ -80oC, được làm tan từ từ trên đá trong 5 phút.
+ Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 àl hỗn hợp phản ứng lai, bỳng nhẹ để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến, ủ mẫu trên đá 30 phút.
+ Mẫu được sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, sau đó được ủ trên đá 3 phút.
+ Bổ sung 1 ml môi trường dinh dưỡng SOC, nuôi cấy trong điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ.
+ Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 3000 vòng/phút, trong 5 phút, loại bỏ 900 àl dịch phớa trờn, trải 100 àl dung dịch cũn lại trờn đĩa thạch LB cú bổ sung ampicilin (50 àl/ml), ủ đĩa ở 37oC, qua đờm.
Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào qua đêm
Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch rắn có bổ sung ampicilin/IPTG/Xgal được nuụi trong 5 ml dung dịch LB lỏng, cú bổ sung ampicilin (100 àl/ml), lắc 200 vòng/phút, qua đêm. Ly tâm lạnh 4oC, 8000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào. Cặn tế bào vi khuẩn được tiến hành tách chiết plasmid.
Tách plasmid
Quy trình tách plasmid tái tổ hợp bằng GeneJET Plasmid Miniprep Kit:
Bước 1: Ly tâm dịch nuôi cấy trong 5 phút, 5.000 rpm, 4oC.
Bước 2: Thờm 250 àl Buffer 1 và mix đều.
Bước 3: Thờm 250 àl Buffer 2, đảo ống 3-4 lần.
Bước 4: Thờm 350 àl Buffer 3, đảo ống 3-4 lần.
Bước 5: Ly tâm 13.000 rpm, 4oC, 10 phút.
Bước 6: Chuyển hỗn hợp lên Binding Column tube, ly tâm 13.000 rpm, 1 phút.
Bước 7: Loại bỏ tube chứa dịch, chuyển Binding Column sang tube mới, thờm 500 àl Buffer D, ủ 5 phỳt. Ly tõm 13.000 rpm, 1 phỳt. Loại bỏ tube chứa dịch.
Bước 8: Thờm 700 àl Buffer 4, ly tõm 13.000 rpm, 1 phỳt, loại bỏ tube chứa dịch.
Bước 9: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút.
Bước 10: Chuyển Binding Column sang ống eppendorf 1,5 ml. Thờm 100 àl Elution Buffer, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 11: Ly tâm 13.000 rpm, 1 phút. Thu dịch, bảo quản ở -20oC. Quy trình kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và AvaII: Bước 1: Thiết lập phản ứng như bảng sau:
Bước 2: Ủ hỗn hợp ở 37oC, 2 tiếng.
Bước 3: Điện di để kiểm tra kích thước sản phẩm.
2.3.2.6.Thiết lập bộ mẫu chuẩn DNA
Nồng độ plasmid tái tổ hợp được xác định bằng hệ thống Nanodrop. Từ nồng độ (ng/àl) quy đổi thành (copy/àl) theo cụng thức sau:
A: Nồng độ plasmid (ng/àl)
N: Kích thước DNA tái tổ hợp (bp)
STT Thành phần phản ứng Thể tớch phản ứng (àl)
1 pGEMT easy 4
2 Buffer 10X 1
3 Enzyme giới hạn 0,5
4 Distilled water 6
Từ dung dịch plasmid ban đầu, 9 dải nồng độ pha loãng với cơ số 10 được tạo ra bằng cách pha loãng plasmid với nước khử ion [10].
2.3.2.7.Tối ưu hóa kỹ thuật real-time PCR
Để xác định điều kiện tốt nhất cho phản ứng real-time PCR, các thành phần của phản ứng real-time PCR được thay đổi với các nồng độ khác nhau. Quá trình này bao gồm thử trên chu trình nhiệt, trong đó lần lượt thử ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau dựa trên đặc điểm, thành phần mồi, kích thước probe, kích thước đoạn gen đích cần khuếch đại và dựa vào chu trình chuẩn của phản ứng real-time PCR.
Đối với phản ứng real-time PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ mồi thích hợp sẽ ảnh hưởng đến việc có cho sản phẩm khuếch đại hay không. Nếu nồng độ mồi quá cao có thể cho kết quả khuếch đại không đặc hiệu và tạo ra cấu trúc nhị phân mồi. Nồng độ mồi quá thấp cũng ảnh hưởng đến việc phân tích kết quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp trừ khi mồi có độ suy biến cao. Để tối ưu nồng độ mồi chúng tôi tiến hành các phản ứng real-time PCR giống nhau về thành phần và chu trình nhiệt, chỉ khác nhau về nồng độ mồi. Chúng tôi tiến hành khảo sát thực hiện phản ứng real-time PCR với nồng độ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại từ 0,1 àM, 0,2 àM ; 0,3 àM ; 0,4 àM; 0,5 àM.
Probe trong phản ứng phải đặc hiệu với trình tự đích và để tạo ra tín hiệu huỳnh quan thì mẫu dò phải nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược. Trong phản ứng realtime PCR với mẫu dò Taqman, khuếch đại không đặc hiệu do mồi sai vị trí hoặc do hiện tượng nhị phân mồi cũng không tạo ra tín hiệu. Do vậy, nồng độ probe cũng ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang và đọc tín hiệu sau mỗi chu kỳ của phản ứng.
Nồng độ probe quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng xấu đến kết quả phản ứng. Để tối ưu nồng độ probe dùng cho phản ứng real-time RT-PCR chúng tôi tiến hành các phản ứng giống nhau về thành phần và chu trình nhiệt, chỉ khác nhau về nồng độ
probe. Chúng tôi tiến hành khảo sát thực hiện phản ứng real-time PCR với nồng độ probe ở cỏc mức 0,05 àM; 0,1 àM; 0,15 àM; 0,2 àM.
Kết quả tối ưu real-time PCR được lựa chọn tại những vị trí cho chu kỳ ngưỡng sớm. Quá trình tối ưu được tiến hành trên mẫu chuẩn có nồng độ 104 IU/ml.
2.3.2.8.Đánh giá kỹ thuật real-time PCR
Đánh giá độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu được xác định thông qua việc lựa chọn các oligo-nucleotide (mồi, probe) đối với từng tác nhân đích cụ thể. Các oligo-nucleotide được kiểm tra bằng cách so sánh trình tự với các trình tự công bố quốc tế để đảm bảo tất cả kiểu gen BKV đều được phát hiện nhưng không bắt cặp với các tác nhân khác.
30 mẫu huyết tương âm tính BKV từ người khỏe mạnh và 30 mẫu huyết tương dương tính với các tác nhân gây bệnh khác (JCV, CMV, EBV, HSV, HBV) được lựa chọn để phân tích, đánh giá độ đặc hiệu.
Hiệu chỉnh nồng độ theo bộ mẫu chuẩn của WHO + Hoàn nguyên mẫu chuẩn WHO trong nước khử ion vô trùng
Mẫu chuẩn WHO BKV-DNA (NIBSC code: 14/212) được hoàn nguyên trong 1 ml nước cất (nuclease-free) với nồng độ gốc 7,2 log10 IU/ml, tương đương với 5,87 x 104 IU/àl.
Hòa tan mẫu trong 20 phút, vortex nhanh, spin mẫu.
+ Thiết lập panel mẫu chuẩn WHO bằng cách pha loãng mẫu chuẩn trong huyết tương âm tính của người khỏe mạnh.
Từ dung dịch stock, pha loóng theo tỷ lệ 1:3 (200 àl chuẩn WHO: 400 àl huyết thanh õm tớnh) để đạt được nồng độ 1,96 x 104 IU/àl.
Pha loóng 10 lần (50 àl mẫu: 450 àl HT õm tớnh) thành cỏc dải nồng độ 1,96 x 103 IU/àl – 1,96 x 10-1 IU/àl.
Tách DNA theo quy trình kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Đức) với thể tớch đầu vào 200 àl mẫu, thể tớch Elution là 54 àl.
+ Thiết lập panel mẫu chuẩn nghiên cứu (LDA)
Từ dung dịch plasmid gốc ban đầu, hòa loãng thành dải nồng độ 104– 100 copy/ àl trong dung dịch TE.
Sau khi thiết lập hai bộ mẫu chuẩn (WHO và LDA), hai bộ mẫu chuẩn được chạy real-time PCR với thành phần của kit nghiên cứu đã được tối ưu.
Xây dựng đường cong tuyến tính bằng phương pháp phân tích hồi quy tuyến tớnh để quy đổi nồng độ copy/àl sang IU/àl.
Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR
Độ nhạy được định nghĩa là nồng độ DNA tập trung ít nhất có thể phát hiện dương tính BKV-DNA với độ tin cậy 95%. Trong nghiên cứu này, độ nhạy của kỹ thuật được xác định dựa trên bộ mẫu chuẩn và mẫu bệnh phẩm.
Trước tiên, chúng tôi khảo sát nồng độ ngưỡng dưới và ngưỡng trên để xác định giới hạn định lượng của bộ mẫu chuẩn. Plasmid gốc được pha loãng với dung dịch TE để thiết lập dải nồng độ từ 10-1-107 (IU/àl), ở mỗi nồng độ tiến hành định lượng BKV-DNA lặp lại 3 lần. Sau đó, so sánh nồng độ thực tế và nồng độ lý thuyết bằng phân tích hồi quy tuyến tính (Excel). Sự tuyến tính giữa các nồng độ trong dãy được kiểm tra bằng phương pháp phân tích hồi quy đa thức [50].
Để khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu lâm sàng, mẫu huyết tương với nồng độ 106 IU/ml (xác định bằng bộ mẫu chuẩn WHO) được pha loãng thành các dải nồng độ khác nhau (bảng 2.4). Ứng với mỗi nồng độ, kết quả được phân tích sau khi chạy lặp lại 12 lần. Sử dụng phần mềm Quodata (quodata.de) để xác định ngưỡng phát hiện.
Bảng 2. 4. Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm Nồng độ (IU/ml) Số lần chạy
900 12
600 12
300 12
150 12
50 12
25 12
Đánh giá độ ổn định của kỹ thuật real-time PCR trong xét nghiệm
Để xỏc định độ ổn định, ba mẫu chuẩn cú nồng độ 101-103 (IU/àl) được chạy lặp lại bảy lần, mỗi lần cách nhau một tháng. Sau đó, dựa vào hệ số biến thiên liên phản ứng để khẳng định độ ổn định của mẫu chuẩn [12]. Để khảo sát hệ số biến thiên liên phản ứng, tỷ số phần trăm giữa độ lệch chuẩn trung bình và trị số trung bỡnh chu kỳ ngưỡng của cỏc mẫu chuẩn 101-103 (IU/àl) được tớnh qua cỏc lần chạy khác nhau. Mẫu chuẩn có độ chính xác cao khi hệ số biến thiên liên phản ứng nhỏ hơn 15% [12].
So sánh bộ mẫu chuẩn nghiên cứu với bộ mẫu chuẩn thương mại
Tiến hành định lượng BKV-DNA trên 30 mẫu huyết tương, nước tiểu bằng bộ mẫu chuẩn nghiên cứu và bộ mẫu chuẩn RealStar BKV PCR Kit. Sử dụng phần mềm Excel 2016 để so sánh, phân tích kết quả định lượng bằng phương pháp hồi quy tuyến tính và thống kê Bland-Altman để đưa ra kết luận cuối cùng về chất lượng của bộ mẫu chuẩn nghiên cứu [19].
2.3.2.9.Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV
Xác định giá trị ngưỡng nồng độ BKV-DNA dự đoán BKVN
Sử dụng đường cong ROC để phân tích giá trị ngưỡng dự đoán các trường hợp BKVN, dựa vào nồng độ BKV-DNA trong máu và nước tiểu ở bệnh nhân ghép
thận. Khoảng tin cậy 95% được áp dụng, ý nghĩa thống kê được công nhận với p<0,05, mối liên quan giữa nồng độ BKV-DNA trong máu, trong nước tiểu với BKVN được thể hiện qua đường cong ROC. Mỗi điểm trên đường cong có tọa độ tương ứng với tần suất dương tính thật (độ nhạy) trên trục tung và tần suất dương tính giả (1-độ đặc hiệu) trên trục hoành. Đường biểu diễn càng lệch về phía bên trên và bờn trỏi thỡ mối liờn quan thu được càng rừ ràng. Độ chớnh xỏc, mức độ hiệu quả xét nghiệm được đánh giá qua diện tích nằm dưới đường cong ROC, cụ thể như sau:
Giá trị đạt 0,9-1: tốt, giá trị đạt 0,8-0,9: khá, giá trị đạt 0,7-0,8: trung bình, giá trị đạt 0,6-0,7: ít và giá trị dưới 0,6: vô nghĩa.
Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng
Khảo sát tỷ lệ nhiễm BKV trên 131 bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật realtime PCR. Những trường hợp nhiễm BKV, được chia thành hai nhóm: nhóm dương tính với BKV và nhóm BKVN. Sử dụng phần mềm thống kê sinh học SPSS (Version 20) để phân tích mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ghép thận qua các kiểm định khi bình phương cho biến định tính, T student và Mann-Whithney cho biến định lượng.
2.3.3. Phân tích đặc điểm di truyền BKV ở bệnh nhân ghép thận 2.3.3.1. Xây dựng cây chủng loại phát sinh
Để phân tích kiểu gen BKV, 26 trình tự tham chiếu bao gồm tất cả các kiểu gen BKV (thu thập từ ngân hàng gen Quốc tế) cùng với các trình tự BKV thu thập từ bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam được so sánh dựa vào phần mềm Bioedit 7.0.
Tiếp tục phân tích, loại bỏ các trình tự thừa và những giá trị gap trước khi xây dựng cây chủng loại bằng phần mềm Mega 7 (www.megasoftware.net). Cây chủng loại được xây dựng dựa vào phương pháp khoảng cách (NJ) với giá trị bootstrap lặp lại 1000 lần.
2.3.3.2. Phân tích đa hình đơn nucleotide (SNP: Single Nucleotide Polymorphism) SNP được định nghĩa là một thay đổi base đơn lẻ trên một chuỗi trình tự DNA mà sự thay đổi đó chiếm một tỉ trọng đủ lớn (trên 1%) trong một cộng đồng