1.5.1. Tình hình nghiên cứu phát triển kit
Nồng độ BKV-DNA xác định bằng kỹ thuật real-time PCR với trình tự đặc hiệu cao của BKV được khuếch đại bằng một đầu dò huỳnh quang và số lượng bản sao khuếch đại được so sánh với đường cong chuẩn được tạo ra với các pha loãng nối tiếp của một nồng độ BKV- DNA đã biết. Hầu hết, các phòng thí nghiệm tự phát triển các xét nghiệm của mình nên đã có sự khác biệt đáng kể về kết quả định lượng và ngưỡng phát hiện. Đồng thời, sự khác biệt về nguồn mẫu, quy trình tách chiết DNA, trình tự primer, probe và chủng BKV được sử dụng cho việc thiết lập đường chuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng và dẫn đến sự khó khăn khi đưa ra các quyết định khi can thiệp điều trị trên lâm sàng. Hầu hết các xét nghiệm real-time PCR định lượng sử dụng chủng BKV kiểu gen I (Dunlop) như là trình tự tham chiếu để thiết kế mồi và probe [4].
Năm 2008, Hoffmann và cộng sự đã so sánh các kết quả từ 7 kit thương mại khác nhau sử dụng chủng Dunlop hoặc mẫu lâm sàng (the mixed patient standard, MPS) làm mẫu tham chiếu, kết quả xét nghiệm cho thấy có hiện tượng không nhất quán (khác biệt > 1 log) được xác định trong 23% các xét nghiệm sử dụng MPS và 94% các xét nghiệm sử dụng Dunlop làm mẫu tham chiếu. Hiện tượng này được phỏt hiện rừ nhất ở kiểu gen III và IV, do sự khụng phự hợp primer, probe cũng như sự đa hình trình tự BKV-DNA [71]. Một công trình khác đã khẳng định rằng các thử nghiệm PCR của BKV bằng cách sử dụng kiểu gen I như là mẫu tham chiếu có thể ít nhạy hơn với các dòng biến thể (ngưỡng phát hiện 104 copy/μl đối với biến thể so với 10 copy/μl cho kiểu gen I). Đây là một vấn đề cần lưu ý vì các biến thể phụ hiếm gặp của BKV có liên quan đến BKVN [69], có lẽ do khó khăn trong việc phát hiện chúng với tải lượng virus thấp. Để khắc phục hạn chế này, các xét nghiệm nên được thống nhất thực hiện ở một phòng thí nghiệm phù hợp, đủ tiêu chuẩn để theo dừi cho một bệnh nhõn, trong trường hợp cú nghi ngờ với cỏc biến thể hiếm gặp trong quỏ trỡnh theo dừi điều trị, biểu hiện lõm sàng của bệnh nhõn khụng tương quan với tải lượng virus, cần thực hiện các xét nghiệm phân tích sâu hơn về kiểu gen [71]. Do các lựa chọn trong điều trị BKVN hiện nay còn hạn chế nên mục tiêu sàng lọc BKV theo quy trình giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân khi có virus nước tiểu hoặc virus máu và can thiệp điều trị phù hợp trước khi phát triển thành BKVN.
Nghiên cứu tại Nhật Bản về phát triển kỹ thuật real-time PCR cho định lượng BKV đã được Iwaki KK và cộng sự công bố năm 2010. Nghiên cứu hướng tới phân tích các điểm đa hình trên một vùng trình tự bảo tồn của BKV (vùng VP2) ảnh hưởng đến xét nghiệm phân tích định lượng BKV. Sử dụng kết hợp các kỹ thuật phân tích, bao gồm phân tích biến đổi trình tự nucleotide trong các chủng của BKV, phân tích và so sánh trình tự axit amin trong vùng gen đích ở các thành viên của họ Polyomaviridae, dựa vào đó thiết kế mồi và probe cho xét nghiệm PCR và phát triển real-time PCR đối với vùng gen đích VP2 của BKV. Kết quả đánh giá sơ bộ cho thấy, thử nghiệm BKV có dải nồng độ rộng 6log với giới hạn phát hiện thấp nhất là 1,5 x 101 copy/phản ứng và độ chính xác cao với hệ số biến thiên nội phản
ứng thấp (CV<5%). Ngoài ra kỹ thuật cũng đưa ra độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với BKV. Công bố này rất có giá trị trong việc đánh giá tác động của các biến thể trình tự vùng VP2, đồng thời cung cấp nguồn dữ liệu phân tử BKV cho các nghiên cứu về dịch tễ học [45].
Nghiên cứu gần đây tại Mỹ (2016) đã so sánh sự khác biệt về nồng độ BKV- DNA khi thiết kế mồi, probe dựa trên trình tự hai vùng gen là VP1 và LTA. Sau khi phân tích hồi quy probit trên những dải nồng độ pha loãng khác nhau cho thấy giới hạn phát hiện của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt là 1,8 x 102 copy/ml và 3,5 x 102 copy/ml với độ tin cậy 95%. Phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu trên 116 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, xác định được độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt là 90%, 96% và 97%, 98% [40].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu hiện trạng nhiễm BKV
Ở nước ta cho đến nay mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm BKV ở bệnh nhân sau ghép thận. Năm 2015, Hà Phan Hải An và cộng sự đã báo cáo một ca lâm sàng BKVN tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức ở một bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối được ghép thận từ người cho sống. Sau ghép 8 tháng bệnh nhân có biểu hiện tăng creatinine mỏu (156 àmol/l) trong khi đú tỡnh trạng lõm sàng vẫn ổn định và các xét nghiệm chức năng khác trong giới hạn bình thường. Để xác định nguyên nhân gây suy chức năng thận ghép, bệnh nhân được chỉ định xác định tải lượng BKV và sinh thiết thận ghép chẩn đoán mô bệnh học. Kết quả xét nghiệm xác định BKV bằng kỹ thuật real-time PCR cho thấy: BKV nước tiểu: 8,27x1010 copy/ml; BKV máu: 1,7x104 copy/ml. Kết quả sinh thiết thận ghép cho thấy có hình ảnh tổn thương ống thận và mô kẽ, thâm nhập tế bào đơn nhân mô kẽ. Không thấy có dấu hiệu tập trung tế bào viêm ở mao mạch quanh ống thận và ở ống thận, nhuộm hóa mô miễn dịch với CD4 âm tính. Từ các kết quả xét nghiệm, bệnh nhân được chẩn đoán BKVN và được điều trị bằng điều chỉnh thuốc ức chế miễn dịch, chức năng thận ghép được cải thiện và ổn định, tuy nhiên không thể hồi phục về
tình trạng ban đầu ngay sau ghép. Từ ca bệnh lâm sàng trên cho thấy vấn đề chẩn đoán BKVN sau ghép còn nhiều thách thức nếu không có cách tiếp cận đúng và việc chỉ định xét nghiệm xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và nước tiểu đúng vai trũ quan trọng trong chẩn đoỏn sớm và theo dừi điều trị BKVN [1].
Công bố của Trịnh Hùng và cộng sự đã phát hiện 2 trường hợp nhiễm BKV (trong đó có 1 trường hợp đồng nhiễm BKV và CMV) trong quá trình sàng lọc và theo dừi điều trị sau ghộp thận tại Bệnh viện 19-8. Bệnh nhõn sau ghộp thận cần theo dừi nguy cơ nhiễm BKV đặc biệt là trong năm đầu tiờn. Sử dụng cỏc cụng cụ chẩn đoán như BKV- DNA trong nước tiểu và huyết tương, đánh giá mô bệnh học thận là rất quan trọng để chẩn đoán sớm. Điều trị bằng việc giảm liều thuốc ức chế miễn dịch để ngăn ngừa tiến triển suy thận ghép giúp đem lại hiệu quả nhất định [2].
1.6. Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh